西藏牦牛源腸出血性大腸桿菌毒力基因檢測與進化分析

趙燕娟 王 剛 索朗斯珠

(西藏農牧學院 動物科學學院， 西藏 林芝 860000)

腸出血性大腸桿菌(EnterohemorrhagicEscherichiacoli, EHEC)是重要的食源性致病菌，人和動物都可成為其傳染源。腸出血性大腸桿菌不僅能引起嚴重的胃腸道疾病[1]，感染嚴重時還可致命。腸出血性大腸桿菌病自1982年于美國首次發現以來，先后在英國、加拿大、瑞典等國家暴發和流行。我國首次于1986年在江蘇省發現該病，隨后蔓延到中部和東部地區[2]。腸出血大腸桿菌菌株的毒力特點有以下幾點：一方面是可產生毒力較強的志賀毒素(Vero毒素)；另一方面是產生親和素從而粘附到宿主細胞上，此外還可產生溶血素[3-5]。腸出血大腸桿菌菌株毒力特點是由多因子決定的，如：志賀毒素由Stx1基因和Stx2基因編碼[5]；eaeA基因編碼的外膜蛋白能產生親和素；ehxA基因編碼的溶血素等同樣也是重要的毒力因素[6]。因此，通過PCR技術對樣品進行毒力相關基因的檢測不僅能作為該病特征性鑒定的一種手段，還可以對由這些基因編碼導致的潛在致病性作出預測。

大腸桿菌O157∶H7是目前最常見的腸出血性大腸桿菌代表菌株[7]。該菌株除引起腹瀉、出血性腸炎外，還可導致嚴重的溶血性尿毒癥[2]。此外，還有O5、O26、O91、O111和O113等血清型，這些血清型菌株對公眾健康造成的危害也不容忽視[3]。目前我國部分地區已經加強了對EHEC O157∶H7的監測，但是其他血清型病原菌的分離鑒定及其流行病學調查方面的研究還沒有完整系統展開[8]。

已有研究表明EHEC主要的自然宿主是反芻動物，因此牛被認為是人感染EHEC的主要來源[9]。盡管很多國家都有關于EHEC在牛群中流行的報道[10-11]，然而在牦牛上還未見報道，本研究前期已做了有關西藏地區牦牛大腸桿菌毒力基因的檢測[12]，本試驗擬通過從西藏7個不同地區采集的牦牛腹瀉糞便以及腸粘膜中分離腸出血性大腸桿菌菌株，后對這些分離菌株進行腸出血性大腸桿菌的相關毒力基因檢測、分型和致病性試驗等鑒定，旨在了解在西藏地區牦牛源腸出血性大腸桿菌的毒力和毒力基因分型情況，以期為研究西藏牦牛腸出血性大腸桿菌病的致病機理和防控技術提供依據。

1 材料與方法

1.1 細菌分布及分離培養

本試驗牦牛源大腸桿菌菌株分別分離自西藏拉薩、林芝、阿里、那曲、日喀則、山南、昌都等7 市地區散養牦牛的腹瀉糞便和病死牦牛的腸粘膜。細菌的分離培養方法見參考文獻[13-14]。

1.2 生化試驗

取本試驗分離鑒定后的純培養物分別進行糖發酵試驗、 M-R、V-P、檸檬酸鹽利用試驗、硝酸鹽還原試驗等常規生化試驗，并觀察反應結果。

1.3 血清型試驗

將本試驗純培養物分別接種于普通瓊脂斜面培養基中，24 h后用0.5%石碳酸生理鹽水清洗，隨后于高壓滅菌鍋中高壓2 h制成抗原。按中國獸醫藥品監察所提供的血清型鑒定說明書，先后進行平板凝集反應、試管凝集反應，最后鑒定出血清型。

1.4 試劑

Taq DNA聚合酶、PCR試劑、核酸染料Gel View 、克隆載體PMD18-T 購自TaKaRa公司；感受態細胞Trans5α由TaKaRa公司制作并保存；膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒由美國OMEGA Bio-tek公司生產；麥康凱培養基、瓊脂糖、LB培養基均由北京陸橋公司生產。

1.5 儀器

高速離心機centrifuge5804由德國Eppendorf生產；PCR儀my cycleTM、電泳儀、凝膠成像系統均由美國Bio-Rad生產；移液器由德國Eppendorf生產；核酸蛋白測定儀由美國賽默飛世爾Thermo公司生產。

1.6 引物設計

從GenBank中檢索已登錄的腸出血性大腸桿菌毒力基因序列(Stx1、Stx2、eae、ehxA、saa、o157)及16SrRNA基因序列(P)信息，用DNA Star軟件找出保守序列，然后采用Primer 5設計引物[15-16](表1)，由上海生物工程有限公司合成。

1.7 PCR檢測

反應體系及反應條件參照參考文獻[17]，反應結束后，取6 μL PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.8 擴增產物的克隆測序

將擴增的目的片段進行純化，純化后在核酸蛋白測定儀上測定濃度，取膠回收純化的DNA 4.5 μL，PMD18-T載體0.5 μL，Solution 5.0 μL，加水到10.0 μL的體系進行，按照試劑盒說明將連接片段轉化到感受態細胞中，轉化后挑取單個菌落接種在保存用平板上，并對單菌落做PCR檢測。驗證正確的即為陽性克隆，挑取驗證正確的單菌落接種于LB細菌瓶中過夜培養，吸取足量陽性的克隆菌液送金斯瑞生物公司進行測序[12]。

表1 腸出血性大腸桿菌毒力基因及16S rRNA基因序列PCR擴增及測序所用引物Table 1 Primers used for the EHEC gene and 16S rRNA gene PCR amplification and sequencing

2 結果與分析

2.1 細菌的地理位置分布與培養結果

本試驗分離菌株在麥康凱培養基上生長形態為中等大小、表面光滑、邊緣整齊的紅色菌落，在伊紅美藍培養基上生長為深紫黑色、光滑、濕潤、帶有金屬光澤的圓形菌落，染色鏡檢結果為革蘭氏陰性、短桿狀、兩端略圓[12]。經細菌分離培養、生化鑒定獲得西藏牦牛源大腸桿菌149株，其中，西藏阿里地區13株、西藏那曲地區12株、西藏日喀則地區13株、西藏山南地區20株、西藏拉薩地區18株、西藏林芝地區77株、西藏昌都地區1株(圖1)。

圖1 149株大腸桿菌的地理位置分布及菌株數Fig.1 Geographical location distribution of the 149 strains of Escherichia coli

2.2 生化鑒定結果

149株分離菌經15項生化試驗，結果見表2，由表可知本試驗分離菌株的生化特性基本保持一致。

表2 生化試驗結果Table 2 Results of biochemical test

2.3 血清學試驗結果

被檢測的149株大腸桿菌中O98、O8、O178、O104、O26等13 種血清型均有檢出，其中O78、O148、O98、O8、O115和O178 檢出率最高，分別占定型菌株的31.54%、7.38%、2.68%、2.01%、8.05%、 2.68%，共占定型菌株的54.34%，可見優勢血清型為O78、O148、O98、O8、O115和O178(表3)。

2.4 腸出血性大腸桿菌的毒力分型鑒定

對149株牦牛源大腸桿菌進行6 對毒力基因檢測，只有14株檢出ehxA基因，檢出的毒力基因菌株的分布情況為林芝市2株、日喀則市3株、昌都市1株、阿里地區8株；拉薩市、山南市和那曲地區未檢出，檢出率為9.40%，部分基因檢測結果見圖2。

2.5 16S rRNA基因克隆的鑒定

PCR產物連接、轉化后獲得陽性重組質粒，經相應的酶切，切出的各基因片段大小與目的基因片段和線性pMD18-T載體大小相符，部分菌株的16SrRNA基因序列陽性結果見圖3。

表3 血清型鑒定結果Table 3 Results of serotype identification

M，DNA標記DL 2 000；1～14 ehxA基因；N，陰性對照M, DNA Marker DL 2 000; 1～14 ehxA gene; N, negative control圖2 ehxA基因電泳圖Fig.2 Electrophoresis map for PCR products of ehxA gene

M，DNA標記DL 2 000；1～6 16S rRNA重組質粒基因M, DNA Marker DL 2 000; 1～6 16S rRNA recombinant plasmid gene圖3 16S rRNA基因重組質粒鑒定的電泳圖Fig.3 Electrophoresis map for PCR products of 16S rRNA gene

2.6 腸出血性大腸桿菌16S rRNA基因序列的同源性分析

對14株牦牛源大腸桿菌分離株的16SrRNA基因片段進行克隆測序分析，發現PCR擴增片段長度約為1 500 bp，與GenBank中登錄的16SrRNA基因序列大小一致。本次分離的牦牛源大腸桿菌16S rRNA核苷酸組內同源性為99%～100%，與GenBank中人源、牛源、禽源、豬源、羊源的部分菌株序列的同源性為99%～100%。采用鄰接法設置bootstrap值1 000進行構建進化樹[12]，所有菌株形成2個主要分支，本次分離的其中13株西藏牦牛源大腸桿菌與人源、牛源、豬源、禽源大腸桿菌形成一個大的分支；Pch1單獨聚為1個分支而且可以看出其與GenBank登錄的J01859.1和M2499.6同源性最近。系統發育樹圖片見圖4。

2.7 腸出血性大腸桿菌毒力基因的同源性分析

通過系統發育分析發現牦牛源腸出血性大腸桿菌菌株內同源性達到99.9%左右，與GenBank中所錄其他菌株的同源性達到99%。采用鄰接法設置bootstrap值1 000進行構建進化樹[12,18-19]，并與GenBank已登錄的EHEC基因序列做了同源性比對并進行了系統發育分 析，所有菌株形成2個主要分支，本次分離的149株西藏牦牛源大腸桿菌屬于ehxA類型的達到14株，與現有的2 893個ST序列相比，其中D1、D2、D4、D5、Dbo、Dch1、DR6與GenBank登錄的EF204922和AF043471同源性最近，Dguo、D3、D6、DR1、DR2與GenBank登錄的CP024291和km880130.1同源性最近。系統發育樹見圖5。

標尺表示遺傳距離，標尺上的0.2指每個位點有0.2個氨基酸替換。The scale indicates genetic distance. Number 0.2 represents 0.2 aa substitutions per site.圖4 16S rRNA基因序列進化樹圖狀Fig.4 Phylogenetic tree graph of 16S rRNA gene sequence

標尺表示遺傳距離，標尺上的0.5指每個位點有0.5個氨基酸替換。The scale indicates genetic distance. Number 0.5 represents 0.5 aa substitutions per site.圖5 EHEC Gene基因序列進化樹圖狀Fig.5 Phylogenetic tree graph of EHEC gene sequence

3 討論與結論

從西藏7個不同地市分離到的149株菌株，根據它們的分離培養特性、染色鏡檢特征及生化反應特點顯示都符合大腸埃希氏菌的基本特征，再結合16SrRNA基因序列鑒定及系統發育分析結果，也能說明149株菌株符合大腸埃希氏菌的特征，故可判斷其為大腸桿菌。

大腸桿菌有很多種血清型，目前國內外已發現的血清型主要是O1、O2、O8、O35、O78、O86等[20-23]。本試驗所分離菌株中 O98、O8、O178、O104等13 種血清型均被檢出，其中 O78、O148、O98、O8、O115和 O178 檢出率最高，分別占定型菌株的31.54%、7.38%、 2.68%、2.01%、8.05%、2.68%，共占定型菌株的 54.34%，可見優勢血清型為O78、O148、O98、O8、O115和O178；O104、O142、O117、O86和O137、O158、O26均有檢出。從中不難看出西藏不同地區其優勢血清型存在差異，這與其他報道一致[22]。

利用6 對腸出血性大腸桿菌毒力基因引物進行PCR檢測，檢出ehxA基因，共檢出1株含有ehxA基因的大腸桿菌，其在西藏的分布情況為：ehxA基因林芝市2株、阿里8株、日喀則3株、昌都1株；拉薩、那曲、山南未檢出。因本次試驗設計的引物是腸出血性大腸桿菌特異性引物，說明西藏林芝市、阿里地區、日喀則市、昌都市這4個地市的牦牛源大腸桿菌中存在EHEC，由于該病危害性較大，有感染養殖人員的可能性[24]，應引起當地的關注和重視，需制定合理的防控措施進行預防本病的發生，特別是阿里地區養殖戶要對本病做好防范。本團隊也會密切關注該病在當地的流行情況，給予長時間的監測，以掌握其流行規律，為當地養殖業的發展提供科學依據。

利用MEGA4.0軟件對14株EHEC進行遺傳進化分析，本次分離的14株EH.EC中D1、D2、D4、D5、Dbo、Dch1、DR6與GenBank已登錄的腸出血性大腸桿菌菌株EF204922(O98∶H-)和AF043471(O8∶H19)同源性最近，Dguo、D3、D6、DR1、DR2與GeneBank登錄的CP024291(O178∶H19)和km880130.1(O104∶H21)同源性最近。這說明此次分離的菌株大多數與國際流行的EHEC血清型O98∶H-、O8∶H19親緣關系較近。其次是以O178∶H19、O104∶H21 2種血清型處在另一個分支上。

大腸桿菌O157∶H7是重要的腸出血性大腸桿菌代表菌株，通過本次血清型結果可以看出此經典血清型菌株在本試驗中未曾檢出，說明所分菌株均不是O157∶H7血清型菌株，本次試驗中檢出的O98 、O8、O178、O104、O26、O137、O142、O115、O117、O158、O148、O86、O78血清型菌株對西藏地區牦牛有一定的致病性，與報道對人致病的主要血清型中只有O104存在交叉，說明這種血清型的菌株對人及牦牛都有致病性，應引起重視。目前對該病的治療尚無有效辦法，最好的防控措施就是加強對該病的監測，防止宿主的感染[16]。