黃體期和卵泡期小尾寒羊KiSS-1與RFRP-3組織表達(dá)研究

安雪姣 潘章源 趙生國 李春艷 田志龍 狄 冉 劉秋月 胡文萍 王翔宇 張效生 張金龍 蔡 原* 儲(chǔ)明星*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193； 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；3.臨沂大學(xué) 農(nóng)林科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂 276005；4.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381)

動(dòng)物的季節(jié)性繁殖是由內(nèi)分泌系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控的復(fù)雜生理過程, 主要依靠下丘腦—垂體—性腺軸(HPG)的相互調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)[1]。研究發(fā)現(xiàn)編碼RFamide家族神經(jīng)肽類的基因KiSS-1與RFRP-3可能是動(dòng)物季節(jié)性繁殖活動(dòng)的重要調(diào)控因子。KiSS-1基因是Lee等[2]從人黑色素瘤細(xì)胞中分離得到，其翻譯產(chǎn)物Kisspeptin是由145個(gè)氨基酸組成的親水性蛋白，具有分泌神經(jīng)肽的特點(diǎn)[3]；KiSS-1/GPR54 系統(tǒng)對哺乳動(dòng)物的繁殖起中樞調(diào)控作用，它通過調(diào)節(jié)下丘腦促性腺激素釋放激素(GnRH)的釋放，來影響促卵泡素(FSH)和促黃體素(LH)的分泌[4-5]。Kisspeptin通過下丘腦通路激活GnRH 神經(jīng)元來促進(jìn)促性腺激素的分泌[6]，也可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的大鼠下丘腦中GnRH 的釋放[7]。Kisspeptin直接作用于下丘腦—垂體—性腺軸，能促進(jìn)GnRH 釋放和LH含量上升，從而調(diào)控綿羊的季節(jié)性繁殖[8-9]。RFRP是在2000年從鵪鶉大腦中提取出來的可抑制垂體GnRH分泌的十二肽，并命名為促性腺激素抑制激素(GnIH)[10]。在哺乳動(dòng)物中RFRP基因由2 條編碼生物活性的短肽RF酰胺相關(guān)肽-1(RFRP-1)和RF酰胺相關(guān)肽-3 (RFRP-3)，其中，RFRP-3 對生殖系統(tǒng)的調(diào)控有抑制作用[11]。小鼠的RFRP-3細(xì)胞纖維體與大部分GnRH 細(xì)胞直接接觸,對GnRH神經(jīng)元有直接的抑制作用[12-13]。在哺乳動(dòng)物中, RFRP-3也能抑制LH的合成與分泌。雖然KiSS-1和RFRP-3都是RFamide家族神經(jīng)肽，但它們在動(dòng)物季節(jié)性發(fā)情中的作用卻相反，并且相互協(xié)調(diào)共同控制動(dòng)物的季節(jié)性繁殖活動(dòng)[14]。目前，對于不同繁殖狀態(tài)下小尾寒羊下丘腦—垂體—卵巢生殖軸上各組織表達(dá)規(guī)律的研究很少。本研究以常年發(fā)情的小尾寒羊?yàn)檠芯繉ο?，分別采集其卵泡期和黃體期生殖軸上的10 種組織，用熒光定量PCR方法檢測KiSS-1和RFRP-3在不同繁殖狀態(tài)下小尾寒羊不同組織中的表達(dá)差異，初步分析這2個(gè)基因在小尾寒羊發(fā)情狀態(tài)轉(zhuǎn)換中的作用，有助于進(jìn)一步揭示綿羊季節(jié)性發(fā)情分子調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品及主要試劑

隨機(jī)選擇來自山東鄆城的身體健康、營養(yǎng)狀況良好、體重一致的2～3歲經(jīng)產(chǎn)空懷小尾寒羊母羊6只， 飼養(yǎng)于天津市畜牧獸醫(yī)研究所試驗(yàn)羊場，保證所有羊只的飼養(yǎng)管理方式、飼料配方和環(huán)境一致。放置孕酮陰道栓(CIDR)并注射5～6 mL維生素AD以保護(hù)陰道內(nèi)膜。放栓12 d后撤栓，撤栓當(dāng)天記為1 d， 撤栓時(shí)刻記為0 h。撤栓后用腹腔鏡觀察卵泡發(fā)育和排卵情況來確定卵泡期采樣時(shí)間，用公羊試情確定母羊發(fā)情狀態(tài)及時(shí)間。連續(xù)試驗(yàn)2個(gè)情期后在撤栓后45 h(卵泡期)和10 d(黃體期)進(jìn)行屠宰，每個(gè)時(shí)期各3只，屠宰后迅速采集下丘腦、垂體、松果體、大腦、小腦、卵巢、子宮、輸卵管、腎臟、腎上腺共10種組織。分別裝入2 mL的RNase-Free凍存管中，并立即放入液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(天根生化有限公司，北京)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit，TaKaRa公司，大連)，熒光定量染料(SYBR?Premix ExTaqTMⅡ，TaKaRa公司，大連)，EP管、96孔板、槍頭等耗材均為RNase-Free產(chǎn)品。

1.2 總RNA提取

利用Trizol(Invitrogen，美國)和動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(天根，北京)提取各組織總RNA。用NanoDrop2000檢測所提取RNA的濃度和OD值(A260/A280為1.8～2.1)，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，檢測合格后暫存于-80 ℃冰箱。

1.3 定量引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank公布的綿羊KiSS-1和RFRP-3基因mRNA序列(登錄號(hào)分別為：NM_001306104.1和NM_001127268.1)，利用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行跨外顯子引物設(shè)計(jì)，以β-actin(登錄號(hào)：NM_001009784)為內(nèi)參基因。引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。引物具體信息見表1。

表1 熒光定量引物信息Table1 Information of primers for Real-time PCR

1.4 cDNA合成

使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)總體積為20 μL。反應(yīng)條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。全程在冰上操作。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行5倍稀釋后，用內(nèi)參基因β-actin進(jìn)行PCR檢測，符合標(biāo)準(zhǔn)后-20 ℃保存。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

取每個(gè)組織的cDNA樣品2 μL混勻，按1∶2濃度梯度稀釋，分別獲得8個(gè)濃度梯度(1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128)的cDNA樣品。用這些cDNA作為模板對目的基因和內(nèi)參基因進(jìn)行熒光定量PCR，以濃度梯度的對數(shù)值(10為底數(shù))為橫坐標(biāo)，以檢測所得Ct值為縱坐標(biāo)，繪制目的基因和內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線，確保引物擴(kuò)增效率為95%～105%。

1.5.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系和程序

利用羅氏480Ⅱ型熒光定量PCR儀檢測不同時(shí)期小尾寒羊在繁殖相關(guān)組織中KiSS-1和RFRP-3基因的表達(dá)，β-actin作為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)體系總體積為20.0 μL，其中SYBR Premix ExTaqⅡ 2.0 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 2.0 μL，RNase-Free ddH2O 6.4 μL。qPCR程序：95 ℃預(yù)變性5 s，95 ℃變性5 s，60 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。

1.5.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用2-ΔΔCt法[15, 16]計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量，用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析， 最終結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(X±SEM)來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取及cDNA合成

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，發(fā)現(xiàn)RNA電泳條帶明亮清晰、完整、無拖尾(圖1)。用Nanodrop 2000檢測各組織RNA的提取結(jié)果，發(fā)現(xiàn)濃度均在100 mg/μL以上，A260/A280均為1.80～2.10。 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA通過β-actin內(nèi)參基因檢測后發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)物干凈單一，表明RNA沒有基因組DNA污染(圖2)。說明提取的RNA和反轉(zhuǎn)錄后的cDNA可用于后續(xù)的熒光定量PCR反應(yīng)。

2.2 KiSS-1和RFRP-3在不同時(shí)期小尾寒羊各組織中的表達(dá)

使用熒光定量PCR技術(shù)對卵泡期和黃體期的小尾寒羊10 種組織KiSS-1和RFRP-3基因的表達(dá)水平進(jìn)行了研究，結(jié)果見圖3和圖4。

KiSS-1基因在2個(gè)時(shí)期小尾寒羊的10種組織均有一定表達(dá)，但在卵泡期子宮中的表達(dá)量很低。黃體期和卵泡期下丘腦KiSS-1基因表達(dá)量顯著高于其他組織(P< 0.05)；卵泡期下丘腦和松 果體KiSS-1基因表達(dá)量顯著高于黃體期(P<0.05)。

RFRP-3基因在2個(gè)時(shí)期小尾寒羊的10種組織中均有一定表達(dá)，但在黃體期子宮及卵泡期垂體和松果體中表達(dá)量很低。黃體期和卵泡期下丘腦和卵巢RFRP-3基因的表達(dá)量顯著高于其他組織(P<0.05)；卵泡期RFRP-3基因在下丘腦和卵巢之間表達(dá)差異顯著(P<0.05)；黃體期卵巢RFRP-3基因表達(dá)量顯著高于卵泡期(P<0.05)。

1～8：大腦、小腦、下丘腦、垂體、松果體、子宮、卵巢和輸卵管。M：DL2000 DNA分子標(biāo)記。1-8，brain, cerebellum, hypothalamus, pituitary, pineal body, uterus, ovary and oviduct. M，DL2000 DNA Marker.圖1 小尾寒羊 RNA電泳檢測Fig.1 Electrophoresis of the RNA in Small Tail Han sheep

1～10：大腦、小腦、下丘腦、垂體、松果體、子宮、卵巢、輸卵管、腎臟和腎上腺。M：DL2000 DNA分子標(biāo)記。1-10：Brain, cerebellum, hypothalamus, pituitary, pineal body, uterus, ovary, oviduct, kidney and adrenal gland. M：DL2000 DNA Marker.圖2 小尾寒羊10種組織中β-actin持家基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 RT-PCR amplification products of housekeeping gene β-actin in Small Tail Han sheep 10 different tissues

*表示差異顯著(P<0.05)，下同。* represents significant difference at P<0.05. The same below.圖3 KiSS-1基因在小尾寒羊不同時(shí)期各組織中的表達(dá)Fig.3 Expression of KiSS-1 gene in Small Tail Han sheep at different periods

圖4 RFRP-3基因在小尾寒羊不同時(shí)期各組織中的表達(dá)Fig.4 Expression of RFRP-3 gene in Small Tail Han sheep at different periods

3 討 論

3.1 KiSS-1基因表達(dá)

KiSS-1基因在動(dòng)物季節(jié)性發(fā)情調(diào)控中起著關(guān)鍵的作用，在阿勒泰羊下丘腦、垂體、卵巢和甲狀腺等組織中均檢測到了KiSS-1基因的表達(dá)，其中下丘腦的表達(dá)量最高[17]。在濟(jì)寧青山羊和遼寧絨山羊下丘腦、垂體、松果體、腎、卵巢、脂肪和甲狀腺等組織中均檢測到了KiSS-1基因的表達(dá)，下丘腦與垂體的表達(dá)量顯著高于卵巢(P<0.01)[18]。梅山豬和長大二元母豬下丘腦KiSS-1基因的表達(dá)量極顯著高于垂體和卵巢(P<0.01)[19]。在初情期母豬下丘腦中成功克隆KiSS-1基因并檢測到該部位有高水平表達(dá)[20]。本研究對KiSS-1基因在小尾寒羊上的表達(dá)情況進(jìn)行了研究，在下丘腦、垂體、卵巢、松果體等組織中均檢測到了KiSS-1基因的表達(dá)，下丘腦中的表達(dá)量顯著高于其他組織(P<0.05)，這與已有研究結(jié)果一致。但是，本研究中小尾寒羊垂體和卵巢中KiSS-1基因的表達(dá)量很低，與黃冬維等[18]和朱碧泉等[19]的研究結(jié)果不同，可能是由于不同物種在垂體中的表達(dá)存在差異所致。

哺乳動(dòng)物促性腺激素的釋放完全依賴于GnRH的分泌，在繁殖季節(jié)或者發(fā)情期綿羊下丘腦的GnRH 神經(jīng)元會(huì)急劇增加[21]，而Kisspeptin的繁殖激活功能主要作用在GnRH神經(jīng)元上。動(dòng)物下丘腦弓狀核以及視前區(qū)的KiSS-1神經(jīng)元軸突末梢可直接投射到GnRH 神經(jīng)元胞體上，建立突觸連接[22-23]，并且其受體GPR54 在大多數(shù)GnRH 神經(jīng)元上表達(dá)[24]。因此，Kisspeptin 被認(rèn)為是GnRH 最有力的激活者。研究發(fā)現(xiàn)小尾寒羊下丘腦KiSS-1基因的表達(dá)量在不同的發(fā)情階段存在顯著差異，其中發(fā)情盛期最高，極顯著高于發(fā)情前期、后期和間情期(P<0.01)[25]。發(fā)情啟動(dòng)后阿勒泰羊下丘腦中KiSS-1基因的表達(dá)量逐漸下降，其中發(fā)情盛期高于發(fā)情末期，都顯著高于間情期(P<0.05)，極顯著高于乏情期(P<0.01)[17]。季節(jié)性繁殖動(dòng)物綿羊在短日照時(shí)(發(fā)情)KiSS-1基因mRNA表達(dá)量高于長日照時(shí)(休情)，其KiSS-1基因主要在情期表達(dá)[26-29]。Abadeh母山羊在繁殖季節(jié)卵泡期下丘腦上的Kisspeptin神經(jīng)元明顯多于黃體期和休情季節(jié)[30]。與本研究發(fā)現(xiàn)小尾寒羊下丘腦卵泡期表達(dá)量顯著高于黃體期的結(jié)果一致。

松果體是動(dòng)物機(jī)體“生物鐘”的調(diào)控中心，能將晝夜明暗循環(huán)和季節(jié)性溫度變化等周期信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)成激素信號(hào), 從而調(diào)整機(jī)體的生理機(jī)能[31]，其中褪黑素是松果體中最重要的產(chǎn)物。褪黑素可能通過Kisspeptin和RF 酰胺相關(guān)肽參與調(diào)控動(dòng)物的季節(jié)性繁殖[32]。在發(fā)情期前對母鹿埋植褪黑素，可使其體內(nèi) FSH的濃度提高，促進(jìn)卵泡的發(fā)育；同時(shí)能顯著提高LH的濃度，進(jìn)一步促進(jìn)排卵，從而達(dá)到使母鹿超排的效果[33]。本研究中卵泡期小尾寒羊松果體KiSS-1的表達(dá)量顯著高于黃體期。上述結(jié)果表明Kisspeptin 在小尾寒羊卵泡期和黃體期中的差異可能是由于褪黑素分泌模式的改變而引起的，并且松果體分泌的褪黑素對短日照繁殖動(dòng)物的生殖活動(dòng)起促進(jìn)作用，通過Kisspeptin參與調(diào)控黃體期到卵泡期的發(fā)情狀態(tài)轉(zhuǎn)換。

3.2 RFRP-3基因表達(dá)

RFRP-3基因在母豬子宮、卵巢及眼等組織中度表達(dá)，在下丘腦高表達(dá)[34]。RFRP-3基因在母綿羊下丘腦等中樞神經(jīng)系統(tǒng)和卵巢等生殖系統(tǒng)的表達(dá)量較高[35]。在幼齡綿羊延髓、眼、卵巢、子宮、下丘腦等組織中均檢測到了RFRP-3基因的表達(dá)，其中延髓表達(dá)量最高，眼、卵巢、脊髓、子宮和下丘腦等組織次之，內(nèi)臟組織最低[36]。天府肉鵝和新西蘭白兔GnIH 前體基因主要表達(dá)于下丘腦[37-38]。濟(jì)寧青山羊和遼寧絨山羊RFRP基因主要在下丘腦、大腦皮層、小腦和卵巢中表達(dá)[18]。本研究用熒光定量PCR的方法檢測到RFRP-3基因在小尾寒羊下丘腦、卵巢、腎臟、大腦、小腦、腎上腺、輸卵管中均表達(dá)，且在下丘腦和卵巢中高表達(dá)。不同物種之間RFRP-3基因的表達(dá)存在一定的差異，這可能是由于物種的特異性引起的。但是RFRP-3基因在小尾寒羊下丘腦和卵巢中高表達(dá)說明該基因在綿羊發(fā)情和繁殖中都發(fā)揮著重要作用。

不同動(dòng)物RFRP-3基因在季節(jié)性繁殖中的作用有所不同。注射RFRP-3可以抑制綿羊GnRH神經(jīng)元的活性[39]；在褪黑素的控制下RFRP-3可以促進(jìn)敘利亞倉鼠GnRH的釋放[40]。RFRP-3基因在處于長光照(16L∶8D)綿羊下丘腦的表達(dá)要高于短光照的綿羊[41]。繁殖期的綿羊RFRP-3基因在PVN和DMH中的表達(dá)量下降，與GnRH神經(jīng)元接觸的細(xì)胞數(shù)量也減少[42]；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，長日照下的季節(jié)性繁殖綿羊與短日照的個(gè)體相比其RFRP的表達(dá)和投射增加[41]；Abadeh母山羊在繁殖季節(jié)卵泡期下丘腦中的RFRP神經(jīng)元明顯低于黃體期和休情季節(jié)[30]。這些研究結(jié)果支持了本試驗(yàn)中小尾寒羊下丘腦RFRP-3基因表達(dá)量黃體期高于卵泡期的研究結(jié)果，表明RFRP-3基因?qū)d羊的生殖活動(dòng)起抑制作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)RFRP-3基因在小尾寒羊卵巢中表達(dá)很高，黃體期顯著高于卵泡期(P<0.05)。豬RFRP-3主要在發(fā)情前期和發(fā)情期的顆粒細(xì)胞以及發(fā)情后期和間情期的黃體細(xì)胞中表達(dá)[35]。研究表明RFRP-3基因在卵巢水平發(fā)揮局部作用，因?yàn)樵摶蛟谌说念w粒細(xì)胞中表達(dá)，同時(shí)能夠減少促性腺激素的釋放和孕激素的合成[43-44]。小鼠卵巢中的RFRP-3與GnRH的表達(dá)密切相關(guān)， GnRH-RFRP-3系統(tǒng)對整個(gè)排卵周期中的卵泡發(fā)育和閉鎖起著重要作用[45]；RFRP-3在一定程度上影響促卵泡素的分泌與合成，參與調(diào)控卵泡的發(fā)育和閉鎖[46]。本研究中RFRP-3基因在黃體期顯著高于卵泡期，說明該基因在調(diào)控發(fā)情的時(shí)候主要在卵巢中實(shí)現(xiàn)功能，可能直接作用于卵泡的發(fā)育和閉鎖。但其在卵巢中具體的功能和調(diào)節(jié)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

KiSS-1基因在小尾寒羊卵泡期下丘腦和松果體的表達(dá)量均顯著高于黃體期，提示其可能在小尾寒羊黃體期到卵泡期發(fā)情狀態(tài)轉(zhuǎn)換中起促進(jìn)作用。RFRP-3基因在黃體期下丘腦表達(dá)量高于卵泡期，說明其可能在小尾寒羊發(fā)情狀態(tài)轉(zhuǎn)換中起抑制作用。RFRP-3基因在不同時(shí)期卵巢差異表達(dá)的研究結(jié)果暗示，RFRP-3基因在調(diào)控發(fā)情的時(shí)候主要在卵巢中實(shí)現(xiàn)功能，可能直接作用于卵泡的發(fā)育和閉鎖。本試驗(yàn)結(jié)果為深入研究KiSS-1和RFRP-3基因在綿羊季節(jié)性發(fā)情方面的作用奠定了基礎(chǔ)。