BST-2在pSS患者唇腺、外周血淋巴細胞中的表達及增殖作用*

張 碩，高爾涵，達林泰，巴格那，楊文博，孫明啟

(1.內蒙古自治區人民醫院口腔科,內蒙古呼和浩特 010017；2.內蒙古醫科大學附屬醫院口腔科，內蒙古呼和浩特 010059)

舍格倫綜合征是指淚腺、唾液腺等外分泌腺的淋巴細胞浸潤，出現進行性破壞的慢性自身免疫性疾病，臨床主要特征為眼干、口干等癥狀，臨床又稱干燥綜合征。原發性舍格倫綜合征(pSS)是指病變主要局限于自身外分泌腺；伴發其他自身免疫性病變者稱為繼發性舍格倫綜合征[1]。pSS的發病機制尚待深入研究，可能與激素水平紊亂、遺傳易感性、病毒等誘發因素密切相關。骨髓基質細胞抗原2(BST-2)是一種天然免疫蛋白，屬于Ⅱ型跨膜蛋白，其相對分子質量為(30～36)×103。有研究指出，BST-2的表達主要受轉錄激活因子3和活化信號傳導的調控，腫瘤細胞中的BST-2過量表達可促使癌細胞侵襲、遷移、增殖[2]。本研究探討了pSS患者唇腺及外周血淋巴細胞中BST-2的表達水平及其對淋巴細胞增殖的作用，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2017年9月至2018年3月在內蒙古自治區人民醫院接受診治的40例pSS患者納入研究作為pSS組，男22例、女18例，年齡25～64歲，平均(46.8±4.2)歲，類風濕因子(150.3±73.4)IU/mL，C反應蛋白(4.5±0.8)mg/L，紅細胞沉降率(22.4±3.1)mm/h，平均病程(34.2±6.8)個月。納入標準：符合世界衛生組織制定的pSS的診斷標準[3]；經臨床檢查、影像學檢查、實驗學檢查確診；均為初診患者。將同期40例體檢健康者作為對照組，男21例、女19例，年齡25～64歲，平均(46.7±4.1)歲。本研究經內蒙古自治區人民醫院醫學倫理委員會審批通過，全部納入研究者均自愿參加本研究并簽署知情同意書。排除標準：接受免疫抑制劑、激素治療者及原發性自身免疫疾病患者。pSS組和對照組的平均年齡、性別構成等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2儀器與試劑 主要儀器包括美國BD公司生產的BD Calibur型流式細胞儀，北京天根生化科技公司生產的高速組織研磨器，美國Eppendorf公司生產的Centrifuge 5417R型臺式高速冷凍離心機，美國ABI公司生產的ABI PRISM 7300型實時熒光定量PCR擴增儀。檢測試劑包括美國BD公司提供的APC凋亡檢測試劑盒，日本同仁化學科技公司生產的CCK-8試劑盒，上海領科生物技術有限公司生產的慢病毒包裝的BST-2過表達載體，美國Sigma公司生產的RPMI 1640培養基，上?；蚩萍加邢薰咎峁┑拿庖呓M織化學二抗試劑盒，美國Abcam公司生產的BST-2、CD19單克隆抗體，上海生工生物技術有限公司生產的BST-2引物，日本Takara公司生產的PCR定量試劑盒、反轉錄試劑盒，美國Invitrogen公司生產的Trizol裂解液，加拿大Cedarlane公司生產的人淋巴細胞分離液。

1.3標本收集

1.3.1切取標本 全部患者接受唇腺活檢手術，取部分唇腺標本，予以甲醛溶液固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制作連續切片，厚4 μm，予以病理學診斷及免疫組織化學染色。其他標本置存于液氮內備用。

1.3.2外周單個核細胞分選 空腹采集15 mL靜脈血，在裝有枸櫞酸鈉抗凝劑的無菌試管內。外周血單個核細胞(PBMC)用淋巴細胞分離液分選，采集三分之一離心后加入Trizol裂解液1 mL，在-20 ℃環境下放置備用。

1.3.3分選B淋巴細胞 將預留的PBMC懸液離心10 min，1 500 r/min，除去上清液，加入磁珠緩沖液80 mL，予以EDTA磁珠緩沖液(終濃度為2 mmol/L，含0.5%BSA)，加入磁珠抗體(CD19)20 μL，冰上孵育20 min，加入緩沖液500 μL重懸，移取至分選柱，緩沖液500 μL潤洗，流凈細胞混合液后，加入2次緩沖液500 μL，轉移分選柱至新的離心管內(容積15 mL)，滴加緩沖液1 mL，針芯推送液體至離心管內，獲得分選出的CD19陽性標記細胞(B淋巴細胞)，離心10 min，除去上清液，加入裂解液1 mL備用。

1.4方法 實時定量PCR檢測：抽提的唇腺組織RNA中加入Trizol，予以高速組織研磨器研磨至勻漿狀態，加入Trizol細胞裂解液，室溫置存5 min，加入氯仿200 μL，劇烈震蕩15 s，室溫置存10 min，4 ℃離心15 min，12 000 r/min，吸取離心后的上層水相至EP管內，加入體積相同的異丙醇，輕輕混勻；室溫下孵育10 min后，4 ℃離心15 min，12 000 r/min，除去上清液，加入75%乙醇1 mL，混勻，無水乙醇，4 ℃離心15 min，8 000 r/min，除去上清液，室溫晾干后，加入DEPC水，混勻吹打后，RNA純度及濃度予以分光光度計檢測。根據試劑說明書操作PCR擴增，由上海生工生物公司合成引物，以管家基因β-actin表達量為內參分析數據。根據試劑盒說明書操作完成免疫組織化學檢測。

2 結 果

2.1實時定量PCR檢測兩組外周血B淋巴細胞和唇腺組織的BST-2表達 pSS組的外周血B淋巴細胞和唇腺組織中BST-2的表達水平明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2免疫組織化學法檢測唇腺組織內BST-2的表達 pSS患者唇腺組織中，在浸潤的局灶性淋巴細胞和少數周圍導管上皮細胞內BST-2表達量較高，而在對照組中僅在導管上皮細胞內散在性少量表達，見圖1。pSS患者唇腺組織的連續切片免疫組織化學染色顯示，唇腺組織內浸潤的局灶性淋巴細胞表達BST-2和CD19，CD19染色陽性細胞和BST-2陽性表達細胞基本一致，見圖2。

表1 兩組間外周血和唇腺組織中BST-2的相對表達水平比較

注：A、B為pSS患者唇腺組織切片染色(A為200×，B為400×)；C、D為對照組唇腺組織切片染色(C為200×，D為400×)；箭頭表示BST-2陽性染色。

圖1免疫組織化學法檢測唇腺組織內BST-2的表達情況

注：A、B為pSS組唇腺組織BST-2染色(A為200×，B為400×)；C、D為pSS組唇腺組織內CD19染色(C為200×，D為400×)；箭頭表示BST-2陽性染色。

圖2免疫組織化學法檢測唇腺組織連續切片的BST-2和CD19表達

3 討 論

目前多數研究BST-2的學者主要將精力集中在其對病毒復制的調控上，BST-2通過限制病毒擴散，從而抑制反轉錄病毒感染[4-5]。同時BST-2作為病毒感染的“感受器”，能誘導NF-κB活性，發揮出免疫防御功能[6]。BST-2能促進人巨細胞病毒進入單核細胞，增強人巨細胞病毒的感染性[7-8]。還有研究顯示，BST-2可作為免疫球蛋白樣轉錄因子7的配體，調控漿細胞樣樹突細胞分泌促炎因子[9-10]。因此部分學者認為BST-2對病毒起到雙重作用，從而導致機體免疫功能紊亂，引起pSS的發生[11-13]。但BST-2在pSS中具體作用機制如何尚未完全明確。檢測pSS患者唇腺及外周血淋巴細胞中BST-2的表達情況，探討其對淋巴細胞增殖的作用已成為醫學研究的熱點[14-16]。

本研究探討了pSS患者唇腺組織及外周血淋巴細胞中BST-2的表達情況及其對淋巴細胞增殖的作用。實時定量PCR檢測顯示，pSS組的外周血B淋巴細胞和唇腺組織中的BST-2表達水平明顯高于對照組；免疫組織化學檢測顯示，pSS組唇腺組織中的局灶性浸潤淋巴細胞和少數周圍導管上皮內BST-2均有陽性表達，而在對照組中僅在導管上皮細胞內有散在性的陽性表達。根據外周血B淋巴細胞BST-2的表達情況分析，唇腺組織內的B淋巴細胞也可能表達BST-2。對pSS組唇腺組織進行連續切片的標本分別進行BST-2和CD19的染色，CD19染色陽性細胞和BST-2陽性細胞基本一致，與姜季委等[17]的研究結果大體一致。BST-2主要通過多病毒的復制進行調控，對病毒的擴散進行限制，對反轉錄病毒感染進行抑制；BST-2可作為病毒感染的“感受器”[18-19]，對NF-κB的活性進行誘導，發揮其免疫防御功能。骨髓基質細胞抗原-2可促使人巨細胞病毒進入單核細胞等表達BST-2的細胞內，增強人巨細胞病毒的感染性[20]。同時，BST-2可作為免疫球蛋白樣轉錄因子7的配體發揮功能，對漿細胞樣樹突細胞產生的其他促炎因子及IFN進行調控，BST-2對病毒的雙重作用引發機體免疫功能失衡，進而導致pSS的發病。

4 結 論

pSS患者唇腺組織和外周血B淋巴細胞BST-2表達水平明顯增高，BST-2可能通過調控腺體內B淋巴細胞的浸潤及增殖，與pSS的發病及進展存在直接聯系。