1例蓋爾森基興諾卡菌血流感染病原學診斷報告

孫 菱，楊建科，郭桂英，歐陽慧，王燕玲

諾卡菌是革蘭陽性的長桿狀、有分支的細菌，抗酸染色呈弱抗酸性，為條件致病菌。諾卡菌屬種類眾多，其中引起人類感染的有十余種，近年來諾卡菌屬的一些新種也陸續被定義，蓋爾森基興諾卡菌(Nocardiacyriacigeorgica)是2001年在德國由Yassin等人從一個慢性支氣管炎病人的支氣管分泌物中發現并重新定義的[1]。諾卡菌病在國內報道中相對少見，其中蓋爾森基興諾卡菌血流感染更為罕見，其臨床表現和影像學缺乏特異性，因此在臨床工作中易誤診、漏診。然而諾卡菌病的病死率高[2]，早期診斷、及時正確的治療可提高其治愈率、改善預后[3]。故本文通過回顧分析樂山市人民醫院1例蓋爾森基興諾卡菌血流感染的臨床資料及文獻復習，加深對諾卡菌的認識，提高其診治水平。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1菌株來源 收集我院腎內科1例諾卡菌感染的臨床分離株，質控菌為金黃色葡萄球菌 ATCC29213、大腸埃希菌 ATCC 35218。

1.1.2主要試劑 環丙沙星、阿米卡星、亞胺培南等抗菌藥物標準品購自大連美侖生物技術有限公司，血瓊脂培養基購自鄭州安圖生物公司。

1.2 方 法

1.2.1臨床資料 患者，男，87歲，因“排尿困難半月，咳嗽、咳痰、言語不清4 d”于2018年1月14日入院。入院半月前患者無明顯誘因出現排尿困難，于4 d前受涼后出現咳嗽、咳痰，咯白色黏液痰，隨后出現言語不清，伴呃逆、雙下肢無力，無意識障礙、暈厥、一過性黑朦及四肢抽搐。既往有慢支炎、肺氣腫病史30年。查體：雙肺呼吸音粗糙，雙下肺聞及濕啰音及明顯哮鳴音，伸舌稍右偏，右側鼻厝溝稍變淺，右側巴氏征可疑陽性。彩超提示：“前列腺測值偏大；前列腺結石。”行胸部CT、頭顱CT(圖1)，報告提示：“1、左側頂葉片狀稍低密度，不除外梗塞可能：雙側側腦室旁半卵圓中心多發缺血缺氧灶，腦白質疏松，腦萎縮。慢支炎、肺氣腫，雙肺炎癥，部分間質性改變。右肺上葉后段片結影：腫瘤？炎癥？雙側胸腔積液。”血常規：WBC22.9×109/L，NEU21.18×109/L，RBC1.91×1012/L，Hb59g/l；CRP153.5 mg/L ；PCT0.495 ng/mL；血清鐵蛋白>1 650 ng/mL；尿常規：紅細胞27/HP，白細胞295/HP；肝功：谷丙轉氨酶87 U/L，谷草轉氨酶122 U/L，白蛋白29.5 g/L，直接膽紅素13.7 mo1/L。入院后經驗性使用哌拉西林他唑巴坦抗感染，并予以擴張支氣管、祛痰、輸血等治療，但患者感染未得到控制。1月18日其血、尿、痰細菌培養結果回示臨床后，改用米諾環素100 mg口服2次/d，復方磺胺甲惡唑片0.96 g口服2次/d。

圖1 CT檢查Fig.1 CT Examination of the patient

1.2.2病原學鑒定 檢驗科微生物室將該患者尿、痰標本接種于血瓊脂平板，同時對標本進行了革蘭氏染色，隨后又行改良抗酸染色。將血培養儀提示有細菌生長的血培養瓶轉接種至血瓊脂平板培養，35 ℃孵育2 d，觀察菌落形態，并染色鏡檢。

1.2.316S rRNA測序 分別從接種血、尿、痰標本的瓊脂平板中挑取多個可疑菌落送成都擎科梓熙生物技術有限公司進行測序鑒定。實驗室提取細菌DNA作為模板，引物為細菌16S rRNA通用引物[4]：27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT，目的片段長度約1 500 bp，反應參數：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環；72 ℃后延伸7 min。

1.2.4藥敏試驗 用微量肉湯稀釋法測8種諾卡菌常用抗菌藥物的最小抑菌濃度(MIC)，包括阿米卡星、頭孢曲松、環丙沙星、亞胺培南、利奈唑胺、米諾環素、莫西沙星、復方磺胺甲惡唑，操作和判讀標準參照美國臨床和實驗室標準協會(CLSI) M24-2A。設置陰、陽性對照，并按相同方法步驟進行質控菌的操作。35 ℃孵育3 d后讀取結果。

2 結 果

2.1患者情況 經抗諾卡菌治療后，于2018年1月27日復查血常規WBC 14.87×109/L， Hb 87 g/L；CRP 33.1 mg/L；PCT 0.118 ng/mL；尿常規：紅細胞5/HP，白細胞5/HP，感染指標較入院時明顯下降，且癥狀較前減輕，但1月31日患者要求自動出院，囑其繼續抗感染治療，并定期門診隨訪以指導用藥，患者依從性差，未執行。

2.2細菌培養及涂片染色結果 鏡檢發現革蘭陽性、分叉的樹枝狀菌體(圖2，B)，檢驗者懷疑為諾卡菌感染，遂行改良抗酸染色(圖2,C)。分別將其血、尿、痰標本的諾卡菌分離株接種于血瓊脂平板分離培養，35 ℃孵育2 d，觀察菌落形態見表面褶皺、干燥的圓形菌落(圖2,A)，不嵌入培養基生長，挑取培養菌落進行改良抗酸染色，呈弱抗酸性(圖2,D)。

2.3測序分析鑒定至種 PCR擴增得到1 500 bp 左右的產物，經BLAST比對分析PCR產物測序結果與NCBI數據庫Nocardiacyriacigeorgica的16S序列(KY363801.1)相似度為99.93%，結果證實該患者血、尿、痰標本中均含有蓋爾森基興諾卡菌。

2.4藥敏試驗結果 結果顯示此株諾卡菌對上述8種抗菌藥物均敏感。

A.Colonies after incubating 48h；B. Sputum smear with Gram staining, ×1000；C. Sputum smear with Kinyoun’stain, ×1000；D.48h Colonies with Kinyoun’stain, ×1000圖2 諾卡菌菌落形態及鏡檢結果Fig.2 Colonial morphology of Nocardia and the result of smear detection

3 討 論

諾卡菌可引起各種臨床感染，從皮膚和軟組織感染到呼吸道、中樞神經等全身各個系統的感染，以肺部感染最為常見。諾卡菌呼吸道定植的重要危險因素有支氣管擴張或其他結構性肺疾病[5]，易感人群為免疫功能低下或合并有慢性基礎疾病的患者，如長期應用免疫抑制劑的患者，獲得性免疫缺陷綜合征、糖尿病、慢性阻塞性肺病等患者[6]，健康人群仍存在感染風險。諾卡菌病的肺部臨床表現主要為咳嗽、發熱、胸痛等非特異性感染的癥狀，實驗室檢驗結果中常有中性粒細胞、CRP、血沉等感染指標升高，影像學檢查亦缺乏特異性改變，可有滲出、空洞、實變、結節、胸腔積液等一種或多種表現。諾卡菌病與普通細菌、真菌感染有相似之處，且涂片呈弱抗酸性易與結核分枝桿菌相混淆，常被誤診以致延誤最佳治療時機。因此對于經驗性抗一般細菌、抗真菌或抗結核治療無效且存在以上危險因素的肺部感染患者，應考慮到此菌感染的可能。

諾卡菌繁殖速度慢，固體培養基上一般需3～5 d肉眼可見，而有些實驗室培養時間不夠，或留取標本前已使用抗生素，另外不合格痰標本進行細菌培養時，口腔菌群的迅速生長使諾卡菌受到抑制，均可一定程度地影響細菌培養的陽性率，造成漏檢。因此對于可疑病例標本，應適當延長培養時間，并在接種培養的同時進行標本的革蘭氏染色涂片鏡檢，當標本中有色素顆粒，取其用玻片壓碎涂片，并做革蘭氏染色，若發現革蘭氏染色陽性分支狀的長桿菌應高度警惕諾卡菌感染，繼續做弱抗酸染色，結果為革蘭染色及弱抗酸染色陽性時，可初步確定為諾卡菌。本例檢驗科微生物室對細菌培養標本進行了常規的革蘭氏染色涂片鏡檢，減少了漏檢率，使臨床第4 d可以正確用藥，對疾病的診斷、治療、預后起到了非常重要的作用。Yasuo T對30份肺諾卡菌病臨床病例進行了研究，革蘭氏染色對諾卡菌病的早期診斷和適當治療是最重要的一步[7]。

北京大學第一醫院的黃磊等人在9年的時間里搜集了我國7個城市的53株諾卡菌進行了分析，研究表明盡管其耐藥率在世界不同區域之間差異很大，磺胺類藥物仍是目前治療諾卡菌病的一線治療藥物，首選復方磺胺甲惡唑。研究結果顯示，在我國，阿米卡星、亞胺培南和利奈唑胺可作為初始經驗性治療諾卡菌病的替代用藥[8]。

綜上，諾卡菌病的診斷主要依靠實驗室檢出病原菌，合格標本的采集和革蘭氏染色涂片對諾卡菌病的早期診斷具有重要作用。不同種別的諾卡菌藥物敏感性有較大差異，建議進行藥敏試驗及精確鑒定以指導正確用藥，16S rRNA測序分析能快速、精確地將諾卡菌鑒定至種。本例病例中檢驗科微生物室對細菌培養標本常規地進行了革蘭染色涂片鏡檢，故及時有效地檢出了諾卡菌，且通過16S rRNA測序分析鑒定此例為蓋爾森基興諾卡菌感染，以期為該細菌今后的研究提供臨床資料參考。

利益沖突：無

本文引用格式：孫菱,楊建科,郭桂英,等.1例蓋爾森基興諾卡菌血流感染病原學診斷報告[J].中國人獸共患病學報,2020,36(1):80-83. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.166