疫苗候選抗原Pvs48/45在中緬邊境的遺傳多樣性特點

魏海潮，王 琳，趙 艷，張學星，胡鈺冰，張楊明慧，王慶輝，曹雅明

瘧疾是由瘧原蟲引起的一種嚴重的寄生蟲病，由感染的按蚊叮咬傳播[1]。至今，全球仍有2.19億瘧疾病例發生[2]。其中間日瘧原蟲(Plasmodiumvivax，P.vivax)是分布最為廣泛的瘧原蟲，尤其在東南亞地區普遍流行[3]。東南亞地區的瘧疾傳播主要集中在國際邊界，中緬邊境地區就是受威脅地區之一[4]，該地區是我國輸入性瘧疾的主要來源，對于我國瘧疾消除計劃的實施是一項復雜而嚴峻的挑戰[5]。近幾年，瘧原蟲的耐藥性和血液期疫苗候選抗原變異的問題使得制備新藥和開發有效的傳播阻斷疫苗(Transmission-blocking vaccines, TBVs)變得十分迫切。TBVs靶向瘧原蟲的有性階段[6]，如配子體階段，按蚊只有從受感染的宿主血液中攝取配子體才能導致瘧疾傳播[7]。P.vivax較早產生配子體，在感染者出現瘧疾癥狀之前即有傳播能力，更適合通過開發TBVs來阻斷其傳播。

Pvs48/45是間日瘧原蟲雌雄配子體表面蛋白，對雄配子受精發揮十分關鍵的作用。Pvs48/45屬于六-半胱氨酸(6-Cys)蛋白家族，由3個同名半胱氨酸富集結構域(cysteine-rich domains, CRDs)組成：CRDI區(aa:26-194)，CRDⅡ區(aa:195-296)和CRDⅢ區(aa:297-415)[8]。早期對Pfs48/45的研究表明其單克隆抗體有效的阻斷了惡性瘧原蟲向按蚊的傳播[9]；膜喂養實驗表明，抗Pvs48/45小鼠血清顯著減少了在蚊子中腸發育的間日瘧原蟲卵囊的數量[8]；近期在大腸桿菌中構建的重組Pvs48/45在小鼠和猴子體內具有良好的免疫原性和傳播阻斷活性[10]。這些研究表明Pvs48/45是一種有前途的TBVs候選抗原。

基因的多態性是評估抗原能否作為疫苗研制靶點的關鍵。同一基因在不同地區的遺傳多樣性成為疫苗廣泛應用的障礙。因此，對不同地區Pvs48/45多態性的分析，可顯著提升疫苗的研究進程。中緬邊境地區作為我國輸入性瘧疾的主要來源，尚未進行過Pvs48/45多態性的研究。本研究通過評估中緬邊境地區Pvs48/45開放閱讀區(open reading frame, ORF)和CRDs的遺傳特點，為Pvs48/45作為中緬邊境地區TBVs候選抗原提供有力的證據。

1 材料與方法

1.1研究地點和樣本采集 經中國醫科大學倫理委員會批準，獲得了所有參與者或其監護人知情同意后，本研究在中緬邊境的Laiza鎮瘧疾診所收集了當地以及周邊村落病人的指尖血，并制備濾紙血樣本。經專業人士通過血涂片鏡檢和巢式PCR，確認單純間日瘧原蟲感染樣本39例，用于Pvs48/45基因多態性分析。

1.2Pvs48/45基因組DNA提取，擴增和測序 根據試劑盒說明書，使用TIANamp Blood Spots DNA Kit試劑(DP318-03,TIANGEN,中國)提取基因組DNA，巢式PCR擴增Pvs48/45的ORF(堿基位點：1-1353 bp；氨基酸位點1-450 aa)，特異性引物如下，First-PCR-F：5′-TCCTCTACACCGCTCTACCG-3′，First-PCR-R：5′-GTGAACCGCATAACTT-TCCC-3′；Nest-PCR-F：5′-GTTTAAACTTAAG-CTTATGTTGAAGCGCCAGCTCGC-3′；Nest-PCR-R：5′-GCCCTCTAGACTCGAGTCAGAAGTACAACAG GAGGAG-3′ 。使用具有強3′-5′校正活性的KOD plus DNA聚合酶(Toyobo，日本)進行擴增。First PCR和 Nest PCR分別在10 μL和30 μL的反應體系中進行。反應體系包含10×KOD-Plus-Neo buffer，2 mmol/L dNTPs，25 mmol/L MgSO4，100 μmol/L of each primer，0.6 units of KOD-Plus-Neo DNA polymerase，以及1 μL gDNA模板。First PCR的擴增條件為98 ℃ 10 s,55 ℃ 30 s,68 ℃ 1 min(30個循環)，68 ℃ 5 min；Nest PCR將退火溫度調至62 ℃，循環數提高至35次。采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測產物；特異性擴增產物送華大基因測序，測序引物為Pvs48/45 seqF: 5′-GAACCATATTCTTACCTA-CC-3′，Pvs48/45 seqR: 5′-AGGAGCATTCTGCGGTCACG-3′。

1.3Pvs48/45基因序列組裝和多態性分析 測序獲得的DNA序列通過MEGA 4.0手動編輯組裝，并使用Clus-talW與Sal-I參考株(PlasmoDB: PVX_083235)進行比對。使用DnaSP v5.10估計分離位點數目(The number of segregating sites，S)，單倍型(The number of haplotypes，H)，單倍型多樣性(Haplotype diversity，Hd)及其標準差(Standard deviation，SD)，以及核苷酸多樣性(Nucleotide diversity，π)[11]。

1.4中性檢驗 為評估Pvs48/45基因的自然選擇模式，通過DnaSP v5.10分別從種內和種間進行中性檢驗。使用Tajima’D 檢驗[12]，Fu and Li’s F*檢驗和 Fu and Li’s D*檢驗[13]進行種內評估。在中性選擇模式下，這些檢驗的期望值為零；正值提示人口瓶頸或平衡選擇；負值則提示人口擴增或方向選擇。以夏氏瘧原蟲(PCYB_121700)作為外群，通過McDonald-Kreitman(MK)檢驗評估Pvs48/45在種間的選擇模式[14]。MK檢驗將種內非同義突變與同義突變的比率(Pn/Ps)與種間固定的非同義突變與同義突變的比率(Dn/Ds)進行比較[15]，Pn/Ps>Dn/Ds表示陽性選擇。利用Fisher’ exact test 對數據進行統計學分析，P<0.05為有統計學意義。

1.5種群分化 使用來自本研究的39例Pvs48/45序列以及從GenBank獲得的27例序列進行種群進化分析，這些序列來自泰國(n=12)、瓦努阿圖(n=9)和哥倫比亞(n=6)[7-8，15]。采用DnaSP v5.10估計Wright固定指數(FST)，以評估Pvs48/45在中緬邊境地區與其他間日瘧原蟲流行區的遺傳分化情況。FST解釋為低分化(>0)，中等分化(>0.05)和高分化(0.15-0.25)[15]。

1.6全球單倍型網絡分析 為了更直觀的比較Pvs48/45基因在中緬邊境地區的單倍型與其他地區的差異和系譜關系，采用NETWORK 4.6的中位數連接法構建基于Pvs48/45序列的單倍型網絡圖。

2 結 果

2.1Pvs48/45基因的遺傳多樣性 與參考序列相比，我們在中緬邊境地區Pvs48/45序列中僅發現了6個突變位點，均為非同義突變(E35K，H211N，K250N，D335Y，A376T，K418R)(圖1A)。其中E35K 位于CRDI區；H211N，K250N位于CRDⅡ區；D335Y，A376T位于CRDⅢ區。H211N、K250N、K418R為固定突變(100%)，D335Y，A376T突變率分別大于60%和80%?；谕蛔兾稽c，將Pvs48/45序列分為5個單倍型(圖1B)，頻率最高的是ENNYTR(56.41%)。有限的突變導致了Pvs48/45的核苷酸多樣性極低(π=0.00064)，CRDⅢ區表現出相對較高的多態性(π=0.00163),而CRDⅡ區完全保守(π= 0)(表1)。

2.2Pvs48/45基因的中性檢驗 種內和種間中性檢驗的結果一致(表2)。Tajima’D 檢驗、Fu and Li’s F* 檢驗和 Fu and Li’s D* 檢驗結果均大于零，在Pvs48/45基因開放閱讀區分別為0.435、0.919、0.901；在CRDI區分別為0.187，0.567，0.530，在CRDⅢ區分別為0.442，0.774，0.785。MK檢驗結果顯示Pn/Ps均大于Dn/Ds,P值在ORF區為0.029；在 CRDⅠ和CRDⅢ區分別為0.190和0.103。

圖1 中緬邊境地區Pvs48/45序列突變位點及單倍型Fig.1 Mutations and haplotypes of Pvs48/45 sequences in the China-Myanmar border

表1 中緬邊境地區39例間日瘧原蟲分離株Pvs48/45基因多態性分析
Tab.1 Polymorphism ofPvs48/45 gene in the China-Myanmar border

NSiteSHHd(SD)πORF391-1326350.633(0.069)0.00064CRDI3976-582120.267(0.081)0.00053CRDⅡ39583-888010.000(0.000)0.00000CRDⅢ39889-1245230.474(0.076)0.00163

N為基因序列數量； Site 為基因位點； S為分離位點； H為單倍型； Hd(SD)為單倍型多樣性(標準差)；π為核苷酸多樣性； ORF為開放閱讀區； CRD為半胱氨酸重復結構域.

2.3種群分化Pvs48/45基因在中緬邊境地區與泰國幾乎沒有分化(FST=0.03)；而與哥倫比亞和瓦努阿圖種群之間呈高遺傳分化(FST>0. 50)(表3)。

2.4單倍型網絡分析 單倍型網絡圖顯示，在東南亞、美洲和大洋洲樣本中共有15種單倍型(圖2)，形成3個明顯的地理集群。中緬邊境地區有5種單倍型(H2、H3、H4、H5、H6)，其中H6為其特異的單倍型；H2為中緬邊境地區頻率最高的單倍型。中緬邊境與泰國地區具有較多相同單倍型，與美洲地區沒有相同單倍型，而與大洋洲只有一個相同的單倍型：H2。

表2 中緬邊境地區間日瘧原蟲分離株Pvs48/45中性檢驗分析
Tab.2 Neutrality tests ofPvs48/45 in the China-Myanmar border

NTajima’DFu&Li’sPvPv/PcD*F*PsPnDsDnPORF390.4350.9190.90103123530.029①CRDI390.1870.5670.5300147100.190CRDⅡ39NANANA002721NACRDⅢ390.4420.7740.7850237160.103

Ps為種內同義突變； Pn為種內非同義突變； Ds為種間同義突變； Dn為種間非同義突變; ①P<0.05

表3 中緬邊境地區與不同流行區間日瘧原蟲種群Pvs48/45基因的遺傳分化程度(FST)
Tab.3 Genetic differentiation (FST) ofPvs48/45 gene in the China-Myanmar border and otherPlasmodiumvivaxepidemic regions

中緬邊境泰國哥倫比亞瓦努阿圖中緬邊境----泰國0.03---哥倫比亞0.710.56--瓦努阿圖0.570.450.80-

圖2 間日瘧原蟲流行區Pvs48/45基因的單倍型網絡圖Fig.2 Haplotype network map of Pvs48/45 gene

3 討 論

瘧疾疫苗是阻斷瘧原蟲傳播的重要手段之一。理想的瘧疾疫苗主要靶向能夠誘導強免疫應答的保守靶位。與紅前期和紅內期疫苗相比，TBVs因具有較低的基因多態性而受到研究者的關注。配子體膜蛋白Pvs48/45是極具應用前景的TBVs候選抗原之一。本研究分析了中緬邊境地區Pvs48/45基因的遺傳特點，并與已報道的全球不同區域的間日瘧原蟲株進行種群分析，評估Pvs48/45的遺傳分化特點，為以Pvs48/45為靶點的TBVs的研發提供理論基礎。

與以往報道一致，Pvs48/45非常保守。我們在中緬邊境地區Pvs48/45 ORF中發現了6個非同義突變位點。其中 H211N ，K250N為全球性突變位點，且在目前報道的研究中均為固定突變，提示這兩種突變可能不會影響Pvs48/45在雄配子受精中的作用。在本研究中，H211N ，K250N是CRDⅡ區僅有的突變，所以在多態性研究中被識別為未突變位點，而導致無核苷酸多態性(π=0)以及無相應的中性檢驗值。在中緬邊境地區發現的突變位點均是已報道過的突變類型，表明Pvs48/45在中緬邊境地區的高度保守性。有限的核苷酸多態性(π=0.00064)也說明Pvs48/45進化保守，這遠低于以往報道的Pvs48/45全球多態性(π=0.00173)[16]。在3個CRD區，CRDⅢ區的核苷酸多態性最高(π=0.00163)，CRDⅡ區最低(π= 0)。且CRDⅢ區的單倍型多樣性(Hd)也明顯高于其他兩個區(Hd=0.474)?？傊?，Pvs48/45核苷酸多態性在中緬邊境地區非常低， CRDⅢ區為基因中多態性相對較高的區域。

在種內中性檢驗結果中，Pvs48/45基因全長以及CRD I區和CRDⅢ的檢驗結果均大于零；在種間檢驗結果中，這些基因片段的Pn/Ps 均大于 Dn/Ds，且在全長基因中具有顯著的統計學意義。這些結果均表明Pvs48/45基因處于平衡選擇，以維持基因在群體中的有限多態性。

種群分化結果顯示Pvs48/45在中緬邊境地區與東南亞國家(泰國)分化程度很低(FST=0.03)，這可能是由于地理上的接近；而與美洲地區(哥倫比亞)和大洋洲地區(瓦努阿圖)之間有著極高的分化水平，尤其與哥倫比亞地區FST大于0.7。由此表明瘧原蟲傳播具有地域局限性。3個明顯的地理集群也說明了這一點，在H1-H11中，除H1為美洲單倍型，其他均為東南亞特異性單倍型；H12和H13為大洋洲特異性單倍型；H14-H15為美洲特異性單倍型。中緬邊境地區有五種單倍型(H2、H3、H4、H5、H6)，其中H6為其特異的單倍型，但其所占頻率很低；H2為中緬邊境地區頻率最高的單倍型，且該單倍型在泰國也存在，因此，在東南亞流行區以H2為基礎的Pvs48/45疫苗有望成為有效的瘧疾傳播阻斷疫苗。

4 展 望

Pvs48/45基因在中緬邊境地區具有低水平的多態性，是一個正在經歷平衡選擇的基因。CRDⅢ區為保守基因中的高多態區，因此可能為疫苗研制的重要靶點。Pvs48/45在全球具有較強的地理分化，進一步提示根據流行區的基因多態性特點開發高效疫苗的重要性。本研究為中緬邊境地區間日瘧原蟲傳播阻斷疫苗的研究和應用提供理論參考。

利益沖突：無

引用本文格式：魏海潮，王琳，趙艷，等. 疫苗候選抗原Pvs48/45在中緬邊境的遺傳多樣性特點[J].中國人獸共患病學報，2020，36(1):07-11. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.187