電針對(duì)功能性消化不良肝郁脾虛大鼠十二指腸黏膜機(jī)械屏障及其調(diào)節(jié)蛋白的影響?

王 丹，張紅星△，榮培晶，侯理偉，李少源，王 瑜，王俊英，張金鈴，趙 斌，國 笑，張 悅，張紫璇，王藝霏，何家愷，韓永麗

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，武漢 430061；2.中國中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700)

功能性消化不良(functional dyspepsia，F(xiàn)D)屬于中醫(yī)學(xué)功能性胃腸病范疇，主要表現(xiàn)為上腹痛或灼燒、餐后早飽、腹脹等，且并無引起這些癥狀的其他疾病，消化系統(tǒng)也無任何器質(zhì)性病變[1-2]。現(xiàn)階段主要認(rèn)為，F(xiàn)D的發(fā)病可能與腦腸互動(dòng)異常、幽門螺桿菌感染、胃腸動(dòng)力障礙、內(nèi)臟高敏感性、腸道菌群失調(diào)、心理及精神因素、谷物過敏(小麥不耐受)以及腸黏膜屏障受損等因素有關(guān)[3-4]。眾所周知，腸黏膜屏障是防止腸內(nèi)毒素等有害物質(zhì)進(jìn)入人體的重要防護(hù)屏障。若腸黏膜屏障受損，則腸腔內(nèi)抗原、菌群、內(nèi)毒素等有害因子進(jìn)入腸深層甚至循環(huán)全身，導(dǎo)致各種疾病發(fā)生。腸黏膜屏障分為機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障及生物屏障。機(jī)械屏障主要由腸上皮細(xì)胞和頂端連接復(fù)合體(apical junctional complex，AJC)構(gòu)成。緊密連接(tight junction，TJ)屬于AJC，可調(diào)控細(xì)胞旁通道，調(diào)節(jié)腸黏膜通透性，防止抗原物質(zhì)進(jìn)入腸黏膜。閉合蛋白(Occludin)和閉鎖小帶蛋白(ZO-1)均是重要的腸上皮TJP，其二者形成穩(wěn)定的連接，對(duì)腸黏膜屏障的完整性有非常重要的意義[5]。有研究發(fā)現(xiàn)[4,6]，F(xiàn)D患者存在十二指腸屏障功能受損。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，電針干預(yù)可提高FD肝郁脾虛大鼠小腸推進(jìn)率，提示電針能改善FD相關(guān)癥狀[7]。因此，本研究從十二指腸機(jī)械屏障角度探究電針治療FD新靶點(diǎn)及FD的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用SPF級(jí)雄性SD大鼠30只，約6～7周齡，體質(zhì)量(200±20)g，由三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào)SCXK(鄂)2017-0012。經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利委員會(huì)許可，飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)SPF動(dòng)物房，12 h/12 h明暗交替，室溫22 ℃～25 ℃，相對(duì)濕度50%～70%,每籠5只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始試驗(yàn),喂養(yǎng)期間自由飲水、攝食。

1.2 主要試劑與儀器

ZO-1抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)21773-1-AP)；Occludin抗體(英國Abcam生物技術(shù)有限公司，批號(hào)Ab216327)；HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司，BA1054)；水合氯醛(上海國藥集團(tuán)公司，批號(hào)40935760)；二甲苯(上海國藥集團(tuán)公司，批號(hào)10023418)；蘇木素(美國Sigma公司，批號(hào)H9627)。

華佗牌0.35×25 mm(1寸)無菌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)；韓式穴位神經(jīng)刺激儀(南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司，HANS-200 A);病理切片機(jī)(德國Leica公司，RM 2016輪轉(zhuǎn)式切片機(jī))；顯微鏡(日本奧林巴斯公司，BX53型生物顯微鏡)；HITACHI電鏡(日本日立高新技術(shù)公司，HT7700-SS/FEI Tecnai G20 TWIN)；自制大鼠鼠衣及懸掛大鼠裝置。

1.3 動(dòng)物分組及造模

將30只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、模型組、電針組各10只。模型組及電針組大鼠參考多因素干預(yù)法[8]并加以適當(dāng)改良，制備FD肝郁脾虛模型。

①冰生理鹽水灌胃：配制0.9% NaCL溶液，置于冰箱中冰凍至-4 ℃，灌胃每次2 mL，每日1次；②夾尾法刺激：用長尾夾包裹紗布以免損傷大鼠尾部，夾在大鼠尾部后2/3處,以不破皮為度,令其暴怒并激怒全籠大鼠，表現(xiàn)為大鼠均站立，雙上肢打斗，每天1次(刺激間隔不少于6 h)，每次30 min；③隔日禁食，飲水正常。以上三法按順序同時(shí)實(shí)施，造模20 d。每日21時(shí)稱大鼠體質(zhì)量并登記，且所有大鼠每日食物等重量。

造模成功標(biāo)志：大鼠體質(zhì)量進(jìn)行性減輕；活躍程度從時(shí)常籠中自發(fā)打斗至喜成堆蜷縮，敲打籠子仍不動(dòng)彈，抓捕反應(yīng)遲鈍；情緒由稍有聲響就易怒煩躁轉(zhuǎn)變?yōu)槌掷m(xù)噪音刺激或是喂食仍無特別反應(yīng)，情緒異常低落；鼠毛從白凈順滑至凌亂、倒張、發(fā)黃；大鼠糞便從深棕色、干燥、質(zhì)硬、無臭、長條圓柱狀進(jìn)展成棕黃色、濕潤、質(zhì)軟、微臭、短條圓柱狀，最后成為黃綠色稀便，可見未消化的顆粒飼料且奇臭。經(jīng)模型評(píng)價(jià)，模型組及電針組20只大鼠造模均成功，在造模期間空白組大鼠給予安靜環(huán)境隔離，不予任何處置。

1.4 電針刺激

造模結(jié)束后第2天開始對(duì)電針組進(jìn)行電針干預(yù)。給電針組大鼠穿上定制鼠衣后懸掛于自制懸掛架上。參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[9]取大鼠“后三里”穴及“太沖”穴，酒精局部消毒后，采用0.35×25 mm(1寸)毫針分別直刺深度約12.5 mm(約0.5寸)、5 mm(約0.2寸)。將雙側(cè)“后三里”穴接韓氏穴位神經(jīng)刺激儀，連續(xù)波，頻率2 Hz，強(qiáng)度1 mA，雙側(cè)“太沖”穴靜留針。每次治療時(shí)間30 min，每日治療1次(9AM～11AM)，治療14 d。空白組和模型組在治療期間給予電針組同樣的穿鼠衣及懸吊，不予其他任何處置，在安靜環(huán)境隔離。在電針組最后1次治療結(jié)束，將各組大鼠稱重并禁食24 h后取材。

1.5 免疫印跡法檢測(cè)十二指腸ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)

取少量十二指腸粉碎組織加入0.3 mL裂解液勻漿后裂解，隨后于4 ℃下12000rpm離心5 min，取上清液。提取總蛋白之后用DG-3022 A酶標(biāo)儀測(cè)定蛋白濃度，隨后將提取的蛋白上清與5ⅹ蛋白上樣緩沖液進(jìn)行沸水浴中10 min，使蛋白變性。配置5%濃縮膠、12%分離膠后開始電泳、轉(zhuǎn)模、免疫印跡顯色等步驟檢測(cè)后得到灰度條帶，采用Image J軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行測(cè)定。

1.6 透射電鏡觀察十二指腸機(jī)械屏障

取1 cm2十二指腸組織塊迅速置于2.5%的戊二醛固定液中，并于4 ℃固定4 h，隨后移除固定液，用PBS漂洗3次，每次15 min。用1%的鋨酸和PBS室溫(20 ℃)固定2 h后再次用PBS漂洗3次，每次15 min。按乙醇梯度(50%-70%-80%-90%-95%-100%)上行脫水，每次15 min。采用丙酮滲透過夜后60 ℃聚合48 h，隨后切成60 nm超薄片。鈾鉛雙染色(2%醋酸鈾飽和水溶液，枸櫞酸鉛，各染色15 min)切片，室溫干燥過夜后用日本HITACHI公司電鏡觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠十二指腸ZO-1、Occludin表達(dá)比較

圖1示，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠十二指腸ZO-1、Occludin表達(dá)顯著減少(P<0.05)。與模型組比較，電針組大鼠十二指腸ZO-1、Occludin表達(dá)明顯增高(P<0.05)。

注：與空白組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05圖1 各組大鼠十二指腸ZO-1、Occludin表達(dá)情況

2.2 透射電鏡下觀察

正常組大鼠十二指腸上皮細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞間隙正常(見圖2A)。模型組電鏡下見十二指腸上皮細(xì)胞間隙增寬，緊密連接模糊，絨毛排列雜亂，線粒體腫脹(見圖2B)。電針組電鏡下見十二指腸上皮細(xì)胞間隙較清晰，未見增寬且絨毛排列整齊(見圖2C)。

注：緊密連接：黑色箭頭；BL:bowel lumen，十二指腸腸腔側(cè)圖2 各組大鼠十二指腸黏膜超微結(jié)構(gòu)比較

3 討論

FD嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，增加了社會(huì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)[10]。在發(fā)達(dá)國家，約有12%～15%的FD患者，且有逐年升高的趨勢(shì)[12]。目前FD的治療方式主要是西藥(促動(dòng)力劑、抑酸劑、抗幽門螺桿菌劑等)，因西藥療效欠佳，無法適應(yīng)復(fù)雜的個(gè)體差異，中醫(yī)療法逐漸被人們認(rèn)可[12]。中醫(yī)療法中，電針治療FD療效滿意[13-18]。本研究采用夾尾刺激等復(fù)合因素造模，使得大鼠暴怒，怒傷肝，肝木克傷脾土，損脾氣，久則陽邪轉(zhuǎn)為陰邪，形成肝郁脾虛證，模型評(píng)價(jià)可證實(shí)。足三里穴為胃經(jīng)合穴，可健脾益氣；太沖穴為足厥陰肝經(jīng)原穴，可疏肝理氣、和胃降逆。本證涉及肝脾，此兩穴合用共奏健脾疏肝之效。

緊密連接蛋白(tight junction,TJ)是參與調(diào)節(jié)黏膜機(jī)械屏障的重要成分之一，其通過調(diào)控內(nèi)皮及上皮細(xì)胞旁通透性發(fā)揮作用[19]。緊密連接蛋白由維持細(xì)胞間屏障的跨膜蛋白及調(diào)控緊密連接蛋白定位的細(xì)胞質(zhì)支架蛋白組成[20]，ZO-1、Occludin為跨膜蛋白。Occludin可調(diào)節(jié)黏膜屏障及細(xì)胞間通透性，是第一個(gè)被確認(rèn)的緊密連接跨膜蛋白。ZO-1表達(dá)在細(xì)胞之間，其定位對(duì)維持TJ的功能至關(guān)重要。ZO-1還可發(fā)揮胞內(nèi)支架蛋白的作用，將Occludin固定于細(xì)胞骨架從而調(diào)節(jié)緊密蛋白完整性[21]。有研究表明[6]，黏膜通透性增加的主要原因是緊密連接蛋白表達(dá)降低，因此ZO-1和Occludin是參與調(diào)節(jié)黏膜機(jī)械屏障的重要蛋白。

本研究結(jié)果表明，模型組大鼠ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)水平顯著降低，且細(xì)胞緊密連接增寬、模糊，絨毛排列雜亂，提示FD的發(fā)病機(jī)制與十二指腸黏膜機(jī)械屏障有關(guān)。經(jīng)治療后，電針組大鼠ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)水平較模型組升高，且細(xì)胞連接及絨毛接近正常，提示電針可能通過調(diào)節(jié)ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)水平，恢復(fù)十二指腸黏膜機(jī)械屏障來治療FD。黏膜屏障包括化學(xué)屏障、機(jī)械屏障及免疫屏障。本研究?jī)H就緊密連接蛋白及細(xì)胞間緊密連接超微結(jié)構(gòu)，反映了機(jī)械屏障方面，擬進(jìn)一步從化學(xué)屏障及免疫屏障角度全面深入探究腸黏膜屏障與FD發(fā)病機(jī)制關(guān)系和電針治療FD的作用機(jī)制。