艾灸足三里對化療后骨髓抑制小鼠Notch信號通路的影響

葉 強，高 彤，梁花花，王亞軍

(甘肅中醫藥大學針灸推拿系，蘭州 730000)

目前在臨床上化療是手術、放療等的輔助療法，同時也是某些癌癥患者的主要療法。化療對腫瘤的增殖、復發、轉移具有顯著的抑制效果，可明顯改善臨床結局。但是由于非靶向化療藥物缺乏對細胞識別的特異性，使其對正常體細胞具有明顯的毒性，這其中尤以化療藥物的骨髓抑制作用導致的免疫抑制毒性最為突出。

中醫在降低化療藥物毒性方面取得了較好效果。張志民等[1]發現，通過在化療期間給予患者中醫扶正培本法治療，可以使急性白血病患者的胃腸道反應、骨髓抑制、肝功能損害、腎功能損害的發生率明顯降低，周圍血常規明顯升高。另外還發現，正茂扶正顆粒[2]、黃芪注射液[3]、參麥注射液[4]、健脾益腎補血法[5]等多種中藥單體或復方均可降低化療藥物對正常細胞的毒性，提高免疫力，緩解化療副作用。大量基礎研究[6-8]發現，艾灸對于化療藥物的骨髓抑制同樣具有明顯的改善作用。足三里是中醫降低化療藥物細胞毒性，改善骨髓抑制最常用的穴位[9-10]，艾灸足三里已被證實在基礎或臨床均可有效降低化療的毒副作用[11-12]，但其分子機制尚不清楚。本研究將在小鼠體內建造骨髓抑制模型，通過艾灸足三里觀察其對骨髓抑制的治療作用，并通過現代分子生物學的方法，初步探索其治療機制，為臨床應用提供理論基礎。

1 材料

1.1 動物及分組

所有無特定病原體SPF級雄性C57BL/6 J小鼠，體質量16～22 g，6～8周齡，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號SCXK(京)2014-0008；Lewis肺癌荷瘤小鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號SCXK(京)2014-0008。所有小鼠均在25 ℃、12 h/12 h的光照周期下自然飲食飲水飼養，并在實驗前均適應性飼養1周。

1.2 試劑及儀器

環磷酰胺(CTX)(上海華聯制藥有限公司，060310)；艾條(李時珍醫藥集團有限公司)；4%多聚甲醛(北京Solarbio生物科技有限公司，P1110)；兔鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司，SP9001)；蘇木素伊紅染液試劑盒(北京Solarbio生物科技有限公司，G1120)；RIPA裂解液(上海碧云天生物技術有限公司，P0013B)；兔抗CBF-1/Suppressor of hairless/Lag(CSL)；多克隆抗體(英國Abcam公司，ab229866)；兔抗Jagged1多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司，bs-1448R)；兔抗Jagged2多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司，bs-4244R)；兔抗Notch1多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司，bs-1335R)；兔抗Notch2多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司，bs-21663R)；兔抗Nocth3多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司，bs-1812R)；Trizol(大連Takara生物技術有限公司，9109)；逆轉錄試劑盒(大連Takara生物技術有限公司，RR047 A)；實時熒光定量PCR(rtPCR)試劑盒(大連Takara生物技術有限公司，RR820 A)；Leica切片機(德國Leica公司，RM2235)；電泳儀(美國Bio-Rad公司，PROTEAN)；PCR擴增儀(美國Bio-Rad公司，T100)；實時熒光定量PCR儀(美國Appliedbiosystems公司，StepOnePlus)。

2 方法

2.1 動物模型分組及其建立

32只雄性SPF級無特定病原體C57BL/6J小鼠適應性喂養1周后，按照隨機數字表法分為正常組、空白組、模型組和治療組每組8只。骨髓抑制模型的建立[13]：無菌條件下剝離Lewis肺癌鼠瘤塊制成勻漿，調整至細胞濃度1 ×107/L，取0.2 ml 接種于每只C57BL/6 J小鼠腋下。接種第7 天選擇腫瘤大小相似的荷瘤鼠，腹腔注射 CTX 100 mg·kg-1·d-1，連續3 d，制成骨髓抑制模型。

2.2 取穴方法

根據華興邦等[14]研究，小鼠“足三里”位于腓骨小頭下約 5 mm 處，后肢膝關節后外側。

2.3 分組與治療

荷瘤鼠隨機分為空白組、模型組、治療組，另設模擬接種的正常組，每組各8只。其中正常組在相同位置接種相同體積但無腫瘤細胞的磷酸鹽緩沖液(PBS)，模型組腹腔注射CTX制成骨髓抑制模型，灌服生理鹽水0.4 ml/d，連續5 d；治療組腹腔注射 CTX 造模，灌服生理鹽水0.4 ml/d，同時將艾條點燃后，高度固定在距離穴位皮膚 2 cm 處，時間為3 min，每日治療1次，連續治療5 d；空白組與正常組每天陪同抓取、固定不治療。

2.4 一般狀況觀察

在整個實驗過程中，每天記錄各組小鼠體質量、飲食、大小便、活動、精神狀況及外觀變化等。

2.5 血常規檢測

各組小鼠在造模前后與治療期間共8 d時間內每天早上 7∶30經尾靜脈取血10 μL，置于事先加好 390 μL 3%冰乙酸稀釋液的試管中，用以檢測外周白細胞計數。

2.6 取材

治療5 d后，各組8只小鼠脫頸處死，在放置干冰的超凈工作臺上取兩側股骨，剔凈骨頭后用生理鹽水沖洗，在75%乙醇中浸泡2 min后再用生理鹽水沖洗，一側股骨立即放入4%多聚甲醛中固定并脫鈣；另一側股骨再用無RNase的生理鹽水沖洗后，在無RNase的環境下用無RNase的PBS沖出其中的骨髓細胞，將所得細胞分成2份，分別于2000rpm離心5 min后，立即提取RNA和蛋白質。

2.7 HE病理檢測

將充分固定和脫鈣的股骨做石蠟切片后，石蠟切片經過二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后放入蘇木素染色，隨后0.5%鹽酸乙醇分化，自來水沖洗返藍。再用95%乙醇浸泡后伊紅染色30 s，經梯度酒精和二甲苯脫水，中性樹膠封片、拍照。

2.8 免疫組化檢測骨髓組織中CSL、Jagged1、Jagged2蛋白的變化

將充分固定和脫鈣的股骨做石蠟切片后，按照1.2.5下過程對石蠟切片進行脫蠟水化，然后將水化的切片放入10mM的pH6.0枸櫞酸鈉溶液中進行微波-酸修復，PBS洗滌3次，滴加3%過氧化氫消除內源性過氧化物酶，PBS洗滌，山羊血清37 ℃封閉10 min傾去勿洗，滴加一抗(稀釋比例)4 ℃孵育過夜，PBS洗滌，滴加生物素標記的二抗37 ℃孵育30 min，PBS洗滌，滴加辣根過氧化物酶(HRP)標記的鏈霉素37 ℃孵育30 min，PBS洗滌，滴加二氨基聯苯胺(DAB)反應液顯色適宜，自來水沖洗，蘇木素復染，鹽酸酒精分化，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡拍照，采用ImageProPlus軟件對陽性顆粒進行測量。

2.9 Western bloting實驗檢測骨髓組織中Notch1、Notch2、Notch3信號通路相關蛋白

骨髓細胞計數離心后，每1×106-7個細胞加入含有1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液500 μL，在冰上裂解30 min，13000rpm離心15 min，取上清10 μL進行蛋白定量。另外上清加入5×上樣緩沖液，100 ℃水浴5 min，依次經過SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜、5%脫脂牛奶封閉，4 ℃孵育一抗過夜，室溫孵育二抗2 h后，增強化學發光法(ECL)顯色，自動曝光儀進行曝光、拍照，半定量分析條帶。

2.10 RT-PCR實驗檢測骨髓組織中Notch1、Notch2、Notch3信號通路相關mRNA

在無RNase條件下骨髓細胞計數離心后，每1×106-7個細胞加入Trizol 500 μL，充分裂解細胞后，12000rpm離心5 min取上清，加入氯仿混勻后室溫靜置5 min，12000rpm離心5 min，取上層水相，加入等體積的異丙醇，室溫靜置5 min；12000rpm離心10 min，管底可見微量RNA沉淀；棄去上清，加入75%乙醇1 mL，懸浮沉淀；12000rpm離心10 min，棄上清，室溫干燥10 min；用20 μL 焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解RNA；然后依次經過逆轉錄反應、實時熒光定量PCR，對RNA進行定量分析。

實時熒光定量PCR的程序如下：Step1：95 ℃ 30 s；Step2：95 ℃ 5s，60 ℃ 30 s；step3：GOTO step2，共計45 個循環數。

表1 引物序列

2.11 統計學方法

3 結果

3.1 行為學觀察

正常組與空白組從造模到治療結束，小鼠體質量增加 1～3 g 不等，精神佳，毛發稠密，毛色光澤，飲食飲水正常，大小便正常，動作靈活，對外界刺激反應靈敏；模型組小鼠從造模到治療結束，小鼠體質量下降 1～3 g 不等，精神差，毛發稀疏，毛色暗淡無光，大便溏，個別小鼠有血便，進食飲水量減少，行動遲緩，多鼠扎堆，對外界刺激反應降低；艾灸組小鼠造模后出現體質量下降 1～3 g不等，精神差，毛色暗淡無光，進食飲水量減少，行動遲緩等情況；治療5 d后體質量基本維持在原基數水平，皮毛尚有光澤，進食飲水量正常，大便正常，無扎堆情況，活動基本正常，對外界刺激反應尚可，較模型組有所改善。

3.2 各組小鼠血液中白細胞數目變化

表2示，正常組及空白組在造模前后的整個過程中，外周血白細胞數目未發生顯著性變化；模型組和艾灸組小鼠在造模前白細胞數目正常，第1次造模后第2天起二者外周血白細胞數目顯著減少(P<0.05)，并隨造模時間的增加和造模次數的增多，白細胞數目逐漸顯著下降(P<0.05)。

表2示，正常組、空白組及模型組在治療前后的整個過程中，外周血白細胞數目未發生顯著性變化，其中正常組、空白組小鼠保持在正常范圍內，模型組小鼠保持在低水平范圍內；艾灸組小鼠在治療前白細胞數目很少，隨治療時間的增加白細胞數目逐漸顯著升高，至第5天時已達到正常水平(P<0.05)。

表2 CTX造模前后及治療前后各組小鼠外周血白細胞計數變化比較

3.3 各組小鼠骨髓病理變化

正常組和空白組骨髓組織結構保持完整，骨髓細胞均一分布；模型組小鼠骨髓組織的結構遭到破壞，骨髓細胞分布紊亂，細胞密度減少；治療組小鼠骨髓組織結構恢復正常，骨髓細胞密度上升，結構完整(見圖1)。

圖1 各組小鼠骨髓病理變化比較(×200)

3.4 各組小鼠骨髓組織中CSL、Jagged1、Jagged2蛋白的變化

圖2示，正常組和空白組小鼠骨髓組織中CSL、Jagged1、Jagged2蛋白變化無差異。與空白組小鼠比較，模型組小鼠骨髓組織中CSL、Jagged1、Jagged2蛋白表達均顯著降低(P<0.05)；與模型組小鼠比較，艾灸組小鼠骨髓組織中CSL、Jagged1、Jagged2蛋白表達均顯著升高(P<0.05)。

注：A.CSL、Jagged1、Jagged2的免疫組化圖；B.各蛋白表達量的半定量統計數據;與空白組比較：**P<0.01；與模型組比較： ##P<0.01圖2 各組小鼠骨髓組織中CSL、Jagged1、Jagged2蛋白變化比較(×200)

3.5 各組小鼠骨髓組織中Notch1、Notch2、Notch3蛋白的變化

正常組和空白組小鼠骨髓組織中Notch1、Notch2、Notch3蛋白變化無差異。與空白組小鼠比較，模型組小鼠骨髓組織中Notch1、Notch2、Notch3蛋白表達均顯著降低(P<0.05)；圖3示，與模型組小鼠比較，艾灸組小鼠骨髓組織中Notch1、Notch2、Notch3蛋白表達均顯著升高(P<0.05)。

注：A.Western bloting蛋白條帶；B.蛋白條帶的統計分析，與空白組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01圖3 各組小鼠骨髓組織中Notch1、Notch2、Notch3蛋白變化比較

3.6 各組小鼠骨髓組織中Notch1、Notch2、Notch3 mRNA的變化

圖4示，正常組和空白組小鼠骨髓組織中Notch1、Notch2、Notch3 mRNA變化無差異。與空白組小鼠比較，模型組小鼠骨髓組織中Notch1、Notch2、Notch3 mRNA表達均顯著降低(P<0.05)；與模型組小鼠比較，艾灸組小鼠骨髓組織中Notch1、Notch2、Notch3 mRNA表達均顯著升高(P<0.05)。

注：與空白組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01圖4 各組小鼠骨髓組織中Notch1、Notch2、Notch3 mRNA變化比較

4 討論

根據2018年全球腫瘤年報[15]，2018年全球新增1800萬癌癥病例及960萬癌癥死亡病例中，中國新增病例數占380.4萬例，死亡病例數占229.6萬例，發病率、死亡率均為全球第一。在治療方面，手術、放療和化療等傳統腫瘤療法是我國臨床及患者的首要選擇。大部分化療藥物是基于腫瘤細胞與正常體細胞之間的增殖差異研發的，通過抑制細胞的DNA合成，阻止腫瘤快速增殖，誘導腫瘤細胞凋亡。成年人的大部分體細胞均處于非增殖狀態或緩慢增殖狀態，化療藥物對其具有較低的抑制毒性，但是骨髓細胞及其免疫系統細胞需要時刻保持高速的增殖速度，以面對內外環境引起的免疫反應，保護機體。因此在化療過程中，化療藥物對骨髓細胞增殖抑制造成的患者免疫抑制，使患者極易發生感染、出血，影響其癌癥治療和生活質量，增加額外的治療成本，甚至威脅生命，因此降低化療藥物的骨髓抑制毒性對患者具有重大意義。本研究發現，在小鼠體上采用艾灸足三里穴位的療法，可有效升高由于化療藥物CTX所導致的減少血液白細胞數目，逆轉改善化療藥物所造成的骨髓組織破壞，解除CTX對骨髓的抑制作用。與前人研究結果一致。

但是艾灸足三里改善化療藥物的骨髓抑制分子機制目前尚不清楚，相關研究比較少。研究發現，Notch信號通路與骨髓的造血功能密切相關，在造血細胞發育的不同階段，Notch 通路可影響其生存、增殖及分化，包括造血干細胞的自我更新及分化[16]；在T 祖細胞進入胸腺發育的過程中，均有 Notch 信號通路的參與[17]，且 Notch 信號通路可促進 T細胞的發育，抑制B細胞發育[18]；現在更多的研究發現，腫瘤性疾病與Notch 信號通路的活化密切關系[19]，因此本研究將基于Nocth信號通路，研究艾灸足三里改善化療藥物骨髓抑制的分子機制。

Notch信號通路由Notch受體(Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)、Notch配體(Delta-like 1,3,4，Jagged1和Jagged2)、CSL DNA結合蛋白及其他效應物和Notch的調節分子等組成。Notch信號的產生是通過相鄰細胞的Notch配體與受體相互作用實現的。Notch蛋白經過3次剪切，由胞內段(NICD)釋放入胞質，并進入細胞核與轉錄因子CSL結合,形成NICD/CSL轉錄激活復合體，從而激活HES、HEY、HERP等堿性-螺旋-環-螺旋(basichelix-loop- helix,bHLH)轉錄抑制因子家族的靶基因，發揮生物學作用。本研究發現，經化療藥物CTX干預后，在蛋白水平上小鼠骨髓組織中CSL、Jagged1、Jagged2、Notch1、Notch2、Notch3蛋白表達均受到抑制，同時在mRNA水平Notch1、Notch2、Notch3的表達同樣顯著下降。但是經過艾灸足三里治療后，骨髓抑制模型小鼠骨髓組織中表達或激活被抑制的CSL、Jagged1、Jagged2、Notch1、Notch2、Notch3蛋白均解除了抑制，表達水平均顯著升高，在mRNA水平Notch1、Notch2、Notch3的表達同樣顯著上升。以上提示，艾灸足三里可激活骨髓抑制模型中被抑制的Notch信號通路，這可能與其減輕化療藥物骨髓抑制密切相關，但具體分子機制還需進一步研究。

綜上可知，CTX可降低骨髓組織中Notch信號通路的激活程度，產生骨髓抑制。艾灸足三里可導致骨髓抑制模型的骨髓組織中Notch信號通路相關蛋白的表達升高，激活Notch信號通路，治療或緩解化療藥物導致的骨髓抑制，但其具體分子機制仍需進一步研究。