加味芍藥甘草湯調控β-catenin/EGFR對子宮腺肌細胞凋亡的影響?

姜心禪，陳曉波，郭宇丹

(1.廣東藥科大學中醫學院，廣州 510000；2.廣東藥科大學附屬第一醫院，廣州 510000；3.廣州中醫藥大學，廣州 510000)

近年來，子宮腺肌病(adenomyosis，AM)的發病率逐年增高，患者的平均年齡降低，育齡期女性比例顯著增加[1]，臨床多以子宮彌漫性增大、不孕、痛經或不規則陰道出血等原因就診[2]。目前除全子宮切除外，尚無根治的方法[3]，這對育齡期女性的身心健康造成了嚴重影響。前期研究表明，加味芍藥甘草湯通過調控P53/LIF/STAT3信號通路，能夠抑制子宮腺肌細胞增生[4]。本研究則在此基礎上進一步探討加味芍藥甘草湯治療AM的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料來源

選擇2018年7月至2018年12月在廣州中醫藥大學第一附屬醫院接受全子宮切除術的子宮腺肌病患者3例(年齡42～54歲)，術前3個月未服用激素。手術室無菌獲取子宮腺肌癥病灶組織約2 cm3，置于冰浴PBS緩沖液中，所取病例均在術后30 min內通過病理檢查確診。本次研究已獲得我院倫理委員會批準，患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、高糖培養基(DMEM)、Ⅰ型膠原酶、2.5 g/L胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；米非司酮片購自北京紫竹藥業有限公司；二甲基亞砜(DMSO)、中藥飲片(芍藥、甘草、當歸、三七和延胡索)購自廣州中醫藥大學中藥房；免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒，購自博士德生物技術有限公司；鼠抗波形蛋白單克隆抗體、鼠抗人廣譜角蛋白單克隆抗體、鼠抗人平滑肌肌動蛋白單克隆抗體，均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；4%多聚甲醛溶液，購自LEAGENE公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒，購自上海貝博生物有限公司；TS-8型轉移脫色搖床，購自江蘇省海門其林貝爾儀器制造有限公司；β-catenin兔單克隆抗體、p-EGFR(Tyr1068)兔單克隆抗體，購自CST公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶，購自GAPDH，SantaCruz公司；BCA法蛋白含量檢測試劑盒，購自南京凱基生物發展有限公司；RIPA裂解液，購自杭州碧云天生物科技有限公司；JEM-1200EX透射電鏡,購自日本JOEL公司；UCT超薄切片機，購自德國LEICA公司；轉移電泳槽，購自上海天能科技有限公司；蛋白電泳儀和垂直電泳槽，購自美國Biorad公司。

1.3 實驗藥物的配制

中藥高濃度組和中藥低濃度組：加味芍藥甘草湯(芍藥15 g，甘草6 g，延胡索15 g，當歸10 g，三七10 g)水提液用無血清的DMEM分別配制成高濃度40 mg/ml和低濃度20 mg/ml的含藥培養液[4]；西藥組：用DMSO溶解25 mg米非司酮片，以無血清的DMEM配成 1×10-5mol/L 的貯備液；空白組：高糖DMEM培養基。

2 方法

2.1 子宮腺肌細胞的原代培養和傳代

在無菌操作臺上用眼科剪取標本中心部位，剪成1 mm3置于25 cm2培養瓶，加0.1 %I型膠原酶適量，置于37 ℃溫箱消化5～6 h。終止反應時加10 %胎牛血清的DMEM培養基，過濾后1000 rpm離心8 min棄上清，重復3次；用10%胎牛血清的DMEM培養基制成5×105個細胞/ml的細胞懸液，5 ml/瓶，37 ℃、5% CO2溫箱培養。

當細胞鋪滿培養瓶底部90 %左右時，需要進行細胞傳代。吸出培養液并以PBS洗凈，將加入1 ml的0.25 %胰蛋白酶培養瓶放入37 ℃、5 %CO2培養箱中3 min。在顯微鏡下觀察細胞形態決定終止消化的時間。加入含10 %胎牛血清的DMEM培養液后吹打細胞，800 rpm離心6 min。棄上清后加入含10 %胎牛血清的DMEM培養液制成1×105個細胞/ml的細胞懸液，接種于新培養瓶中。

2.2 細胞的免疫組化鑒定

第一次傳代細胞消化制成5×105個細胞/ml的細胞懸液，接種在12孔板中的爬片上，于37 ℃、5 %CO2培養箱中培養，24 h后加入含10 %胎牛血清的高糖DMEM培養液，繼續培養3 d后，以PBS沖洗3次，4 %多聚甲酸固定30 min；0.5 %Triton X-100孵育20 min，PBS清洗3次；3 %H2O2去離子水室溫孵育15 min，PBS清洗3次；滴加5 %BSA液以封閉，室溫放置30 min，加入相應的一抗(平滑肌蛋白抗體、波形蛋白抗體、角蛋白抗體)后，4 ℃過夜；加生物素化二抗，于37 ℃中30 min，PBS清洗；滴加鏈霉素化親和素試劑，置于37 ℃中30 min，PBS清洗；DAB顯色：加入試劑后在鏡下觀察，控制顯色程度；滴加蒸餾水終止染色，洗凈后蘇木素復染10 min，滴加蒸餾水使反應終止；取出爬片脫水、透明、封片、讀片、拍片，用PBS代替一抗作為陰性對照。

2.3 透射電鏡觀察加味芍藥甘草湯對細胞凋亡的影響

各組細胞經藥物干預后制成細胞懸液，加入等體積2.5%戊二醛固定液，2000 r/min離心10 min棄上清。加入胎牛血清和戊二醛入離心管，2000 r/min離心10 min棄上清。以2.5%戊二醛固定30 min后，PBS緩沖液清洗3 min×3 次，加1 g/L四氧化鋨固定30 min棄固定液，PBS緩沖液清洗3 min×3 次，乙醇梯度脫水后包埋，聚合72 h切片、染色，透射電鏡下觀察并拍片。

2.4 流式細胞術檢測加味芍藥甘草湯對細胞凋亡的影響

將細胞消化離心后種入6孔板里，放至5 %CO2、37 ℃培養箱中，至其融合度約90 %舍棄原培養液，加無血清的高糖DMEM培養液，放至5 %CO2，37 ℃培養箱中24 h，使細胞生長同步化。加入各組藥物后再培養24 h取出，用預冷的PBS洗1次棄上清；加適量0.25%的胰蛋白酶3 min(鏡下觀察其形態變化)，加2倍體積的含10 %胎牛血清DMEM培養液，終止反應；輕輕吹打貼壁細胞，1000 g離心5 min制成細胞懸液。加入5 μL Annexin V-FITC輕輕混勻后，于4 ℃避光條件下孵育15 min。加入10 μL 碘化丙啶后輕輕混勻，于4 ℃避光條件下孵育5 min，1 h內上機檢測。

2.5 劃痕實驗檢測加味芍藥甘草湯對細胞遷移能力的影響

在6孔板中接種各組細胞，待融合度約為90 %時棄培養液，用PBS洗2次，加入無血清的DMEM饑餓處理24 h。棄培養液用10 μL槍頭劃痕，PBS洗2次后于倒置顯微鏡下攝片。等間距得在劃痕邊緣取6點測量寬度，取其平均值，記為0 h時劃痕寬度；每空中加入相應藥物作用24 h后，再以相同的觀察點測量寬度。劃痕愈合率(%)=(0 h寬度-24 h寬度)/0 h寬度×100%。

2.6 Western blot檢測加味芍藥甘草湯對細胞中β-catenin、EGFR和p-EGFR蛋白的表達

收集細胞用冷PBS清洗2遍后，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解，12000 g 4 ℃離心15 min，取上清液測定蛋白含量，-80 ℃保存。蛋白用沸水煮5 min，SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，用電轉移法使蛋白轉移至PDVF膜上，5 %的脫脂牛奶封閉2 h后孵育對應的2種一抗，4 ℃搖床過夜。PBST清洗后孵育二抗，室溫下輕搖2 h。ECL法發光，用Image QuantLAS4000(GE Healthcare)測定灰度值。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 原代培養細胞鑒定

經免疫細胞化學法(角蛋白、波形蛋白、平滑肌肌動蛋白)鑒定(如圖 1)，所培養的3例原代細胞均為子宮腺肌細胞。

注：A.角蛋白;B.波形蛋白;C.平滑肌肌動蛋白(圖中箭頭指出的棕褐色部分均為相應蛋白表達位置)圖1 免疫細胞化學法鑒定子宮腺肌細胞比較

3.2 AM細胞超微結構的變化

注：A.中藥高濃度組(染色質塊狀邊集并出現凋亡小體和大量空泡)；B.中藥低濃度組(染色質散落于核膜下，有空泡樣改變)；C.西藥組(核仁稍縮小，染色質部分凝聚);D.空白組(細胞未見凋亡改變)圖2 各組藥物干預24 h后子宮腺肌細胞超微結構比較

圖2示，各組藥物作用24 h后，中藥高濃度組細胞胞體變小，胞質濃縮，胞內核仁縮小，線粒體出現大量空泡，染色質呈塊狀凝聚并散落分布等改變，有明顯的凋亡表現；中藥低濃度組細胞核仁縮小，染色質邊聚于核膜下，部分線粒體空泡樣變；西藥組細胞核仁稍有縮小，部分染色質凝聚，線粒體有空泡樣變趨勢；空白組細胞核中常染色質多，胞漿中可見正常的線粒體、內質網等細胞器，無細胞凋亡變化。

3.3 細胞凋亡率測定

中藥高、低濃度組細胞的凋亡率明顯高于空白組，差異有統計學意義(P<0.05)。中藥高濃度組或中藥低濃度組與西藥組之間比較，差異無統計學意義。

3.4 AM細胞遷移能力的改變

各組藥物作用24 h后，西藥組、空白組細胞不同程度地向中間遷移，而中藥高濃度組細胞間隙反而增大。遷移率如表2所示，高濃度和低濃度的加味芍藥甘草湯均能抑制AM細胞的遷移，與空白組比較差異有統計學意義(P<0.05)，與西藥組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 加味芍藥甘草湯對子宮腺肌細胞凋亡率影響比較

表2 加味芍藥甘草湯對子宮腺肌細胞遷移率影響比較

注：A.中藥高濃度組;B.中藥低濃度組;C.西藥組;D.空白組圖3 AM細胞凋亡流式圖

3.5 AM細胞中β-catenin、EGFR和p-EGFR蛋白的表達量

圖4示，中藥高濃度組和中藥低濃度組細胞中β-catenin、EGFR和p-EGFR蛋白的表達均低于西藥組和空白組，與空白組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

表3 加味芍藥甘草湯對子宮腺肌細胞中β-catenin、EGFR和p-EGFR蛋白表達的影響

注：a.中藥高濃度組;b.中藥低濃度組;c.西藥組;d.空白組圖4 AM細胞中β-catenin、EGFR和p-EGFR蛋白表達

4 討論

子宮腺肌病的發病機制尚不確定[6]，唯一根治的方法只有全子宮切除術，然而術后患者將喪失生育能力，目前接受度很低[3]。中醫藥治療本病可以保留患者的生育能力，同時能夠緩解引導不規則出血、痛經等不適，有效地降低西藥和手術治療的副作用，具有不可替代的優勢[5]。

子宮腺肌病屬于中醫學“癥瘕”范疇，多是由于瘀血蓄積于胞宮、阻滯氣血沖任所致，故臨床多表現為下腹部腫塊、行經腹痛、經期延長和不孕等。針對瘀血阻滯、不通則痛的病機，臨床當以活血化瘀為主，輔以行氣止痛。加味芍藥甘草湯正是以活血行氣、化瘀止痛為法，由緩急止痛的經方芍藥甘草湯化裁而來，并結合前期臨床療效觀察、中藥水煎劑HPLC指紋圖譜分析、細胞實驗和動物實驗優化組方[7-9]，篩選出白芍、炙甘草、當歸、三七、延胡索5味藥組成本方。研究顯示，加味芍藥甘草湯水提液能夠下調芳香化酶，阻斷病灶局部E2正反饋循環，并通過抑制c-Fos/c-Jun、P53/LIF/STAT3、RAS/MAPK/ERK等信號通路,降低子宮腺肌病病灶細胞的異常增殖,阻礙子宮腺肌病的發展[4,10-11]。

細胞凋亡是機體為維持內環境的平衡和穩定，由基因控制的細胞自主的有序死亡，然而腫瘤細胞的顯著特性之一就是異常增殖。因此許多抗腫瘤藥物都會從促進腫瘤細胞凋亡或抑制腫瘤細胞增殖的角度進行研究。本研究顯示，經加味芍藥甘草湯處理后，子宮腺肌細胞的超微結構出現核仁縮小、染色質邊聚、凋亡小體形成等凋亡樣改變，有效促進了子宮腺肌細胞凋亡，同時抑制細胞遷移。

細胞行為學的變化與蛋白的表達息息相關，通過前期文獻研究發現，表皮生長因子受體EGFR(epidermal growth factor receptor，EGFR)是調控細胞增殖的關鍵因子，參與多條信號通路，誘導細胞的增殖、分化和侵襲等過程，在腫瘤形成過程中具有重要意義[6]。同時β-catenin與EGFR關系極為密切，在EGFR的作用下，β-catenin聚集于核內誘導細胞增殖；另一方面，β-catenin直接靶向EGFR并激活下游信號通路，兩者之間存在相互作用[12]。此外，β-catenin在子宮腺肌病上皮細胞中表達升高，異常激活的β-catenin誘導子宮內膜上皮間質化，促進子宮腺肌病的發生[13]，通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路，有效控制子宮腺肌細胞增生[14]。同時考慮到EGFR只有磷酸化形成p-EGFR后才能真正發揮調控信號通路的作用，所以檢測經中藥處理后細胞內β-catenin、EGFR和p-EGFR蛋白的表達。研究結果顯示，加味芍藥甘草湯對于降低EGFR、p-EGFR和β-catenin的表達是有顯著性差異的，提示在EGFR和p-EGFR表達降低后，抑制β-catenin在核內的表達，促進細胞凋亡；同時β-catenin表達水平降低后，減弱對EGFR的靶向激活作用，也加速細胞凋亡的發生。本研究進一步闡釋了加味芍藥甘草湯治療子宮腺肌病的作用機制，為臨床治療本病提供了新思路與實驗基礎。