芪黃疽愈方對ASOLE大鼠肝臟脂質代謝相關因子表達的影響?

張 靜，葛建立，張 欣，張敏妹，何建明，李曉東，馬云龍，孫云朝，楚信強，白建英

(1.河北中醫學院，石家莊 050200；2.河北省中醫院，石家莊 050011；3.石家莊市中醫院，石家莊 050051)

下肢動脈硬化閉塞癥(arteriosclerosis occlusive disease of the lower extremities,ASOLE)是動脈硬化在下肢的特殊表現[1-2]。動脈硬化發病原因及形成機制復雜[2-4]，肝臟B類Ⅰ型清道夫受體(scavenger receptor class b type Ⅰ,SR-BⅠ)、過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)-α、單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)等對動脈硬化的形成具有重要調控作用[5-7]。課題組既往的臨床研究證實[8]，芪黃疽愈方能夠有效改善ASOLE患者臨床癥狀，但具體生物學機制尚不明確。本研究以ASOLE大鼠為實驗對象，通過觀察芪黃疽愈方對肝臟SR-BⅠ、PPAR-α、MCP-1等因子表達的影響，探討其治療ASOLE的分子生物學機制。

1 材料

1.1 動物

清潔級Wistar大鼠58只，9±1個月齡，體質量200±20 g，由河北醫科大學實驗動物中心提供，合格證號1704031，由河北中醫學院實驗樓喂養。飼養環境為獨立的不銹鋼通氣籠，每籠5只，動物房溫度23 ℃～25 ℃，相對濕度40%～70%，明暗光照各12 h交替進行。實驗用普通全價顆粒飼料和高脂飼料均購自河北醫科大學實驗動物中心。本實驗已通過河北中醫學院實驗動物倫理委員會審查。

1.2 藥物

芪黃疽愈方中藥飲片由紅花、雞血藤、海藻、浙貝母、鬼箭羽、蟲、延胡索、黃芪、黃精、牛膝組成，由國藥樂仁堂石家莊藥材有限公司生產；維生素D3針劑由上海通用藥業股份有限公司生產。

1.3 試劑

兔抗SR-BⅠ一抗(Abcam，貨號：ab52629)；山羊抗兔二抗-HRP(Easybio，貨號：BE0106)；ECL顯色試劑盒(Thermo，貨號：34094)；PPAR-α酶聯免疫檢測試劑盒、MCP-1酶聯免疫檢測試劑盒，貨號：ml0045637、ml0022423，購自上海紀寧實業有限公司。

1.4 儀器

Western Blot電泳儀基礎電源 PowerPacTMBasic(BIO-RAD公司)；近紅外雙色激光成像系統(Odyssey公司)；HBS-1096C Pro自動酶標儀(上海珂淮儀器有限公司)。

2 方法

2.1 動物分組及造模

動物適應性喂養1周后，隨機取10只作為正常組，余下大鼠采用高脂飲食加隱動脈內膜損傷的方法[9]制作ASOLE模型。1%戊苯巴比妥鈉(1 ml/200 g)腹腔注射麻醉，左后肢消毒，從腹股溝中點向后肢內側縱行切開皮膚，分離并暴露隱動脈，用動脈夾阻斷隱動脈遠近端約1.8±0.1 cm，取胰島素注射器1支，沿隱動脈血管長軸由遠端向近端刺入血管腔，將0.25 mL注射用無菌蒸餾水緩慢注入阻斷部位血管，5 min后取下針頭和動脈夾，壓迫止血并縫合切口。并在實驗開始時在大鼠右下肢肌肉注射維生素D3針劑(3×105u/kg)，每隔30 d重復1次。采用隨機數字表法將ASOLE大鼠分為模型組、芪黃疽愈方高濃度組、中濃度組、低濃度組各12只。實驗期間模型組和中藥組持續高脂飼料(83.5%基礎飼料，5%豬油，1%膽固醇，0.5%膽酸鈉及10%蛋黃粉[10])喂養，空白組普通飼料喂養，均自由飲水。

2.2 給藥方法

芪黃疽愈方組成：紅花12 g，雞血藤15 g，海藻12 g，浙貝母12 g，鬼箭羽12 g，蟲9 g，延胡索12 g，黃芪20 g，黃精12 g，牛膝9 g。按原方的組方比例，并根據體表面積比率折算出200 g大鼠的等效用藥劑量作為其用量，另取其1/2劑量和2倍劑量作為芪黃疽愈方低濃度和芪黃疽愈方高濃度組。由河北省中醫院煎藥室煎制，4 ℃冰箱保存1周內使用；芪黃疽愈方中濃度組的藥物最終濃度0.4 g生藥/mL，低濃度組0.2 g生藥/mL，高濃度組0.8 g生藥/mL，實驗過程中每次中藥制劑均按同一標準進行。

造模后1周，模型組和中藥組(芪黃疽愈方低濃度組、中濃度組、高濃度組)分別給予生理鹽水(1 ml/100 g)或相應濃度中藥灌胃(1 ml/100 g)，每日1次，連續12周，空白組大鼠則不予處理。

2.3 標本采集及處理方法

取材前夜禁食水。10%水合氯醛溶液(0.3 ml/100 g)腹腔麻醉，剪開皮膚摘取肝臟組織，切割標本后，一部分勻漿充分后離心20 min左右(2000～3000 r/min)，仔細收集上清液用于ELISA檢測；一部分直接裝入凍存管中，-80 ℃保存，待行Western印跡法檢測。

2.4 指標檢測

2.4.1 一般狀態 觀察大鼠的一般狀態，包括精神狀態、毛色、活動靈敏度、飲食、飲水及體質量。

2.4.2 Western印跡法測定肝臟SR-BⅠ表達 制備SDS-PAGE膠板，根據蛋白定量結果，加入相應體積的總蛋白樣品與5×蛋白質凝膠電泳上樣緩沖液混合，于95 ℃變性10 min后迅速置于冰水中冷卻，依次加樣。恒壓電泳，恒流濕轉，封閉1 h后依次與一抗(兔抗SR-BⅠ，1∶1000稀釋)孵育過夜，洗滌后放入二抗(山羊抗兔)孵育1 h，曝光顯色后掃描處理，所得條帶吸光度值分別與對應內參計算比值獲得相對吸光度值[11-12]。

2.4.3 ELISA法檢測肝臟PPAR-α、MCP-1表達 根據試劑盒說明書嚴格操作，采用ELISA法檢測肝臟PPAR-α、MCP-1表達水平。加樣、加酶、溫育(37 ℃，60 min)配液，洗滌、顯色(37 ℃，15 min)、終止，450 nm波長檢測吸光度值(OD值)[13]。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 大鼠一般狀態

實驗發現，空白組大鼠毛色光澤，活動靈敏，飲食、飲水量正常，體質量隨飼養時間延長而增加；模型組、中藥組大鼠在最初1個月增長迅速，后增長速度減緩，其精神萎靡，活動欠靈敏，毛色暗淡，食量相對正常組也減少。直至實驗藥物干預12周結束時，除模型組、中藥低濃度組各死亡1只外，其余各組均無大鼠死亡。

3.2 各組大鼠肝臟組織SR-BⅠ表達水平比較

圖1示，與空白組比較，模型組SR-BⅠ的表達明顯降低；與模型組比較，中藥各濃度組SR-BⅠ的表達明顯升高，且SR-BⅠ的表達水平隨中藥濃度增加而升高。

圖1 各組大鼠肝臟組織SR-BⅠ蛋白免疫印跡條帶圖

3.3 各組大鼠肝臟組織PPAR-α、MCP-1水平比較

與空白組比較，模型組大鼠肝臟PPAR-α顯著性下降(P<0.01)。中藥處理有效升高大鼠肝臟PPAR-α水平，效果與藥物濃度呈正相關；高、中濃度組較模型組顯著性升高(P<0.01)，低濃度組較模型組雖有上升但無統計學意義。

與空白組比較，模型組大鼠肝臟MCP-1顯著性上升(P<0.05)。中藥處理有效降低大鼠肝臟MCP-1水平，效果與藥物濃度呈正相關；高濃度組較模型組顯著性降低(P<0.01)，中、低濃度組較模型組雖有下降但差異無統計學意義(見表1)。

表1 各組大鼠肝臟組織PPAR-α、MCP-1檢測結果比較

4 討論

脂代謝異常導致高炎癥狀態是動脈硬化形成的核心機制[3、14]。肝臟是機體調節血脂水平的主要臟器之一[5、15-17]，通過調節血脂改變機體炎癥狀態是其參與動脈硬化形成、預防、治療的重要機制[3、14、18]。肝臟SR-BⅠ、PPAR-α、MCP-1在調節血漿膽固醇、脂肪酸等血脂水平及機體炎癥狀態中發揮了重要作用。SR-BⅠ參與肝細胞選擇性攝取血漿結合膽固醇(主要為高密度脂蛋白膽固醇)，也是協助肝細胞將代謝后的膽固醇通過膽汁，經膽道、腸道排出體外的重要分子[5、17]。肝細胞內活化的PPAR-α通過調節參與脂肪酸轉運、結合、活化過氧化物酶和線粒體的脂肪酸β氧化的相關基因，促進脂肪酸的攝取、利用和分解代謝[6、19]。MCP-1具有趨化單核細胞等功能[20、21]。單核-巨噬系統具有轉運血脂的功能，同時也是參與炎癥的重要細胞[7]。因而，肝臟SR-BⅠ、PPAR-α、MCP-1在調節血脂、降低機體炎癥水平、抗動脈硬化中扮演著重要角色。

高脂飲食加隱動脈內膜損傷是目前較為成熟且被廣泛接受研究ASOLE的模型方法[9]。本實驗利用該模型研究芪黃疽愈方治療ASOLE的作用機制。模型組血管壁結構破壞且顯著性增厚，可見泡沫細胞浸潤血管壁等，基本符合動脈硬化的病理表現，驗證了此方法的有效性。進一步實驗發現，芪黃疽愈方顯著性升高肝細胞SR-BⅠ、PPAR-α表達，降低肝臟MCP-1水平。結合課題組既往的研究報道[22]，即調節血脂參與芪黃疽愈方治療ASOLE的機制，說明調節肝臟SR-BⅠ、PPAR-α、MCP-1表達應是其調節血脂降低機體炎癥狀態，治療ASOLE的具體機制之一。

本病屬于中醫學“脫疽”范疇。中醫認為，癥積阻絡不通、氣血周流受阻是導致ASO的病機關鍵，故治療ASOLE需以消癥通絡為基本法則。目前研究證實，活血、消癥、通絡、益氣的單味中藥具有抗動脈硬化、促進下肢血液循環的作用。藥理學研究表明，紅花主要成分為羥基紅花黃色素A等，可以降低膽固醇，防止動脈硬化及機體代謝紊亂[23-24]。雞血藤醇提物有較好的調節血脂和抗脂質過氧化作用[25]；浙貝母能降低全血黏度，抑制紅細胞聚集[26]；海藻可有效提高高密度脂蛋白水平，加速低密度脂蛋白代謝，阻止氧化低密度脂蛋白所引發的對內皮細胞的損傷[27]。“芪黃疽愈方”是本院治療ASOLE的經典方劑，方中紅花、雞血藤活血化瘀通絡，浙貝母、海藻化痰散結，四藥合用消癥通絡為君藥；鬼箭羽、蟲、延胡索協助主藥增強活血化瘀之效為臣藥；黃芪、黃精益氣養陰固本為佐藥；使以牛膝引血下行。諸藥合用，標本兼治，使癥積得化，經絡暢通，諸癥悉除。早期臨床應用“芪黃疽愈方”治療ASOLE取得了滿意療效，但作用機理不明。課題組在前期臨床研究的基礎上，以“芪黃疽愈方”對ASOLE大鼠進行干預，進一步檢測組方藥效，探討作用機理。結果表明，芪黃疽愈方能夠有效促進SR-BⅠ蛋白表達，升高PPARα，降低MCP-1，通過調節脂質代謝、降低炎癥反應，治療ASOLE，但其深入的作用機制尚待進一步探討。