水通道蛋白4在乳腺癌細胞侵襲轉移中的作用

李英彬 孫圣榮

乳腺癌(BC)是女性最常見的惡性腫瘤[1]，其發生機制不明。水通道蛋白(aquaporin，AQP)家族是一種疏水性跨膜蛋白，大小為26～34 kDa，廣泛地存在于包括哺乳動物在內的多種生物中[2]。目前，在哺乳動物中已經發現至少13種AQP亞型[3]。Aquaporin 4(AQP4)是AQP家族的一員，在維持水和離子平衡中起關鍵作用。有研究發現，AQP4在腫瘤的發生發展中起著重要作用[4]。敲除AQP4能抑制成年小鼠腦室下區神經干細胞的增殖，遷移和神經分化[5]。Shi等[6]篩選在乳腺癌組織中的AQP的表達譜時發現，AQP4在腫瘤組織中的表達水平顯著高于正常組織，這說明它在乳腺癌發生發展中可能起一定的作用。本研究擬研究AQP4的表達水平及其在乳腺癌發生發展中的作用。

對象與方法

一、材料

人乳腺癌細胞株MDA-MB-231，T47D，MCF-7 和 ER-ZR-70均購買于中國科學院細胞生物學研究所(上海)。

二、方法

1.小干擾RNA(siRNA)處理：T47D 和MCF-7細胞瞬時轉染，將siRNA和Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)分別與Opti-MEM無血清培養基混合，再將二者混合后處理腫瘤細胞，6小時后更換為正常培養基。

2.RNA的分離和實時PCR鑒定：總RNA使用RNeasy 試劑盒進行提取。使用PrimeScript RT-PCR試劑盒對1 μg的總RNA進行反轉錄(Takara Bio，Tepco，Japan)，通過PCR檢測AQP4mRNA的表達(引物：5′-GCTCAATAGCTTTAGCAATTG-3′，吉凱基因公司合成， 上海)。

3.蛋白免疫印跡：細胞樣品使用1×RIPA細胞裂解液進行蛋白裂解，超聲波破碎，離心得上清，100℃煮樣10分鐘，SDS-PAGE膠分離蛋白，特異性抗體孵育(抗-AQP4：SantaCruzBiotechnology sc-20812，SantaCruz，CA，1：1000；抗-β-actin：SantaCruzBiotechnology sc1616，SantaCruz，CA，1：1000)。實驗結果使用Odyssey?Imager 軟件(LI-COR，Lincoln，NE，USA)對條帶的熒光強度進行分析，以β-action條帶的相對熒光強度值作為實驗數據分析對照。

4.劃痕試驗：人乳腺癌細胞在含有1%胎牛血清的培養基中饑餓處理24小時，之后使用標準的200 μl 無菌槍頭對細胞爬片進行劃線。細胞劃痕的愈合情況由光鏡下檢測到的細胞生長遷移距離來進行評估。

5.腫瘤細胞侵襲實驗：腫瘤細胞侵襲實驗根據細胞穿透Transwell小室(Costar，Cambridge，MA，USA)基質膠的程度來進行評估。在光鏡下計數預先設立的5個區域內穿過基質膠的腫瘤細胞的數目。

三、統計學分析

結 果

1.AQP4在人乳腺癌細胞系中表達特性：首先通過Western Blot試驗驗證AQP4在人乳腺癌細胞系中的表達，以β-actin作為對照(圖1)。

AQP4在T47D和MCF-7細胞系中的表達高于MDA-MB-231和ER-ZR-70。因此，我們選擇 T47D 和MCF-7 細胞系做進一步研究。利用siRNA技術沉默T47D和MCF-7細胞中AQP4 mRNA的表達，通過RT-PCR分析和免疫印跡分析檢測AQP4的表達(圖2)。以無序的核苷酸序列同樣轉染入細胞株內作為(siCtrl)陰性對照，AQP4mRNA相對表達量，siAQP4/MCF-7組和siAQP4/T47D組均比對照siCtrl組低(P<0.01)。以β-actin蛋白為內參，AQP4蛋白的表達水平，siAQP4/MCF-7組和siAQP4/T47D組均比空白對照siCtrl組低，差異有統計學意義(P<0.05)，說明經過siRNA沉默后，AQP4 mRNA和蛋白表達均明顯減少。

圖1 Western Blot檢測不同乳腺癌細胞系中AQP4的表達情況

2.沉默AQP4顯著降低乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力：AQP4敲除的乳腺癌細胞系中，劃痕愈合所需的時間明顯比相應的對照組更長。敲除AQP4顯著降低了乳腺癌細胞的遷移能力(圖3)。遷移結果在0小時siAQP4/T47D及siAQP4/MCF-7組與siCtrl組無明顯差異， 24小時內siCtrl組組內對比細胞愈合率明顯上升，說明細胞遷移距離增加，24小時內siAQP4/T47D及siAQP4/MCF-7組組內對比細胞愈合率上升相對緩慢。但同時間點實驗組與對照組細胞愈合率比較，差異有統計學意義(P<0.05)，siAQP4組劃痕愈合能力明顯受到抑制，表現為劃痕愈合面積縮小，劃痕愈合面積內細胞遷移數量明顯下降(圖3)。細胞愈合率siAQP4/T47D組和siAQP4/MCF-7組低于siCtrl組，差異有統計學意義(P<0.05)，表明經轉染后沉默AQP4的T47D和MCF-7細胞的遷移能力下降。

將siAQP4 T47D、 siAQP4MCF-7組細胞及未處理細胞和對照組(siCrtl)細胞分別接種于Matrigel膠鋪就的Transwell小室中，48小時后固定染色。

侵襲實驗顯示 siAQP4細胞和siCtrl細胞在侵襲能力上有明顯差異(P<0.05)(圖4)。細胞定量分析表明siCtrl組穿過的細胞數目較siAQP/T47D 組高2.3倍(P<0.05)，較siAQP/MCF細胞高 2.0倍(P<0.05)。結果表明siAQP4組乳腺癌細胞的侵襲能力明顯降低，說明AQP4蛋白對乳腺癌細胞的侵襲能力有重要作用。

圖4 Transwell小室實驗

討 論

遷移是細胞基本特性，這一過程出現在損傷后組織修復、炎癥反應、新生血管形成和腫瘤擴散等生理和病理過程中[7]。細胞遷移能力降低通常會導致侵襲能力的下降[8]。根據對培養中遷移細胞的觀察，將細胞遷移分為四個過程：極化、突起、牽拉和收縮[9]。其中，質膜突起由肌動蛋白重組構成偽足結構為細胞遷移提供基礎，水在細胞內外的流動為細胞遷移提供動力[10]。有研究顯示，AQP作為一種肌動蛋白，其聚合/解聚引起跨膜離子流結果導致靠近前緣處的遷移細胞的細胞質出現滲透壓的快速變化，促進滲透水流穿過質膜滲入細胞突起，導致細胞的運動[11]。在水通道的調節中，磷酸化是一個很重要的過程，從機制上來看，AQP4含有PKA和PKC磷酸化的同源序列，這些水通道受磷酸化作用直接調節，并認為磷酸化與AQP的運輸、門控以及重新分布有關，可見磷酸化直接影響其功能[12]。

腫瘤侵襲和轉移是在多基因協同作用下，癌細胞通過與宿主細胞以及細胞外基質等多因素之間相互作用及信號整合的結果。在侵襲轉移過程中腫瘤細胞的黏附、分泌蛋白酶、運動三種行為互相協調，在不同的時間和空間進行著精細的調控[13]。在腫瘤的轉移擴散中，癌細胞與癌細胞黏附和解離起著決定的作用。有研究發現，癌細胞在原發灶脫落、侵入轉移位點并增殖的一系列過程中所涉及的細胞-細胞、細胞-基質間的相互作用由特異性黏附分子介導的[14]。

乳腺癌細胞的遷移和侵襲可能與AQP磷酸化介導的細胞運動有關，在此基礎上腫瘤細胞間黏附力的降低可能促進這一過程。這種生物學行為信號傳導的研究是一個廣泛而復雜的過程。有研究顯示，替莫唑胺通過下調AQP4的表達以及激活MAPK信號通路，進而降低膠質瘤細胞的遷移及轉移能力[15]。胡慧等[16]研究STAT3通路通過介導MMP-2和MMP-9的表達抑制乳腺癌的侵襲和轉移。AQP在乳腺癌中作用通路研究較少，測試何種機制介導AQP在這些過程中的作用也是本實驗未來研究重點。完整的通路研究有利于開發AQP4成為乳腺癌治療的新靶點。