基于表達和反應耦聯的羥基化酶催化合成反式-4-羥基-L-脯氨酸

景曉冉，聶 堯，徐 巖，2

(1.江南大學 生物工程學院工業生物技術教育部重點實驗，江蘇無錫214122；2.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122)

反式-4-羥基-L-脯氨酸(trans-4-Hpro)是藥物合成中一種重要的中間體[1-3]，可以用來合成碳青霉烯類抗生素類高附加值藥物[4-5]，同時在材料化工、食品營養和護膚美容方面也具有廣泛的應用價值[6-7]。目前，隨著生物技術的快速發展，生物合成trans-4-Hpro的研究引起人們的廣泛關注。

1995年，Serizawa等[8]發現一株可被命名為ClonostachyscylindrosporaSANK 14591的菌株，外源添加L-脯氨酸(L-Pro)可以合成13.8 mg/L的trans-4-Hpro。1996年，Lawrence等[9]從StreptomycesgriseoviridusP8648 中純化出脯氨酸4-羥化酶，并對該酶的特性進行了初步研究，每毫克蛋白每分鐘的羥脯氨酸產量僅為907 pmol/L。2000年，Shibasaki等通過全細胞酶活測定篩選出來源于Dactylosporangiumsp. RH1活性最高的P4H[10]，以Escherichiacoli(E.coli)W1485 作為宿主菌進行重組表達，并以E.coliW1485 pTrS2-4OH為菌株進行發酵培養，在發酵罐中外源添加L-Pro獲得了15 g/L的trans-4-Hpro[11]。2006年，Bontoux等[12]在反應體系中添加10 mmol/L的L-Pro為底物，在250株野生菌中篩選出5株可轉化生成trans-4-Hpro，產率均在5%～10%。2013年，劉合棟等[13]將優化后的P4H基因插入含有色氨酸串聯啟動子的pUC19 質粒，并導入E.coliBL21(DE3)中，在搖瓶水平添加200 mmol/L L-Pro為底物發酵8 h，可積累0.492 g/L 的trans-4-Hpro。2017年，周海巖等[14]將源于BradyrhizobiumjaponicumUSDA 6的脯氨酸4-羥化酶在E.coliBL21(DE3)中進行重組構建，采用全細胞催化反應體系，經過體系的優化，trans-4-Hpro的合成量達到34.86 mg/L。

雖然目前已有許多生物催化轉化羥基脯氨酸研究的相關報道，但能夠高效羥基化L-Pro的酶資源仍然有限。微生物合成法生產trans-4-Hpro的過程中，菌體生長緩慢，很難達到高密度發酵，L-Pro的有效轉化率較低，從而造成生產原料的浪費。本研……