60Co-γ輻射對黃瓜種子萌發及幼苗生長的影響

陳玉霞， 鉏曉艷， 邱建輝， 谷 峰， 林 勇， 劉尚洪

(湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所，湖北武漢 430064)

黃瓜(CucumissativusL.)為葫蘆科1年生草本植物，是漢朝張騫出使西域時帶回來的，最初為野生，瓜色墨黑帶刺，味道非常苦，不能食用，后來經過長期的栽培、改良，才成為現在甜脆可口的黃瓜。黃瓜中含有蛋白質、脂肪、糖類、多種礦物質、微量元素和維生素，其中維生素E含量較高。黃瓜具有清熱解毒、調理腸胃、清肺利尿的功效，是人們最常食用的瓜類蔬菜[1]。人們生活水平的提高，對蔬菜的無公害化、周年供應等提出了更高要求，只有培育抗多種病害的黃瓜品種，才能使黃瓜生產無公害和高產穩產成為現實。要在現有基礎上育成有突破性的抗病新品種，必須通過創新材料，如發病較嚴重的枯萎病，現有抗源很少，通過輻射誘變，將可獲得高抗枯萎病的突變體，從而獲得創新材料。據國際原子能機構(International Atomic Energy Agency，IAEA)2000年統計，全世界利用輻射育種技術育成作物新品種2 252個，其中我國育成農作物品種605個，占世界總和的26.9%，平均推廣種植面積達9×106hm2以上，育成的新品種為我國增加糧食 30億～40億kg，棉花1.5億～1.8億kg，油料 0.75億kg，創經濟效益33億元[2]。但目前輻射技術在黃瓜上的應用僅有少量報道，李加旺等利用60Co-γ射線輻射處理具有優良特性的黃瓜自交系干種子，并在其變異后代群體中篩選出2個綜合性狀優良的單株，經3代系選，從中選出主要性狀能穩定遺傳的株系M-8，并以其為親本育成適于日光溫室栽培的耐低溫弱光雜交一代新組合93-5黃瓜[3]。王玉懷利用60Co-γ射線輻射長春密刺干種子，從中發現黃色子葉突變的幼苗，研究表明黃色子葉為核遺傳的隱形性狀，受核內一對等位基因控制，該性狀可作為苗期標記鑒別F1雜種[4]。本研究以60Co-γ射線輻照黃瓜品種新津春4號干種子，考察不同輻照劑量對黃瓜種子萌發、種子細胞膜透性、幼苗子葉葉綠素含量、幼苗生長量、幼苗各部位鮮質量和干質量的影響，并探明黃瓜輻射誘變的半致死劑量，旨在為黃瓜抗病新品種的選育提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試品種 新津春4號干種子，牛皮紙袋包裝，每袋100粒，共8袋。

1.1.2 輻照設備 湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所輻照中心60Co-γ射線源，設計裝源容量1.85×1016Bq，現有放射源活度1.26×1016Bq，單板3層排列。采用動態步進式輻照方式輻照黃瓜干種子。

1.1.3 儀器試劑 UV-vis8500紫外可見分光光度計、Sartorius電子分析天平、精密電導率儀、培養皿、濾紙、小刀、直尺、刻度試管、移液管、稱量瓶、丙酮。

1.2 方法

1.2.1 試驗時間和地點 2017年6月在湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所輻照黃瓜種子并進行種子發芽試驗和幼苗觀察檢測分析。

1.2.2 處理設計 共設8個處理：處理1輻照劑量為0 Gy(未輻照種子作為對照)、處理2輻照劑量為50 Gy、處理3輻照劑量為100 Gy、處理4輻照劑量為255 Gy、處理5輻照劑量為500 Gy、處理6輻照劑量為675 Gy、處理7輻照劑量為 880 Gy、處理8輻照劑量為1 000 Gy。

1.2.3 發芽率及生長量測定 樣品輻照完畢后，每個處理各取種子30粒，分別放入8個100 mL燒杯中，加水浸種4 h。將濾紙置于培養皿中作發芽床，將種子置于濾紙上，保持濾紙濕潤，30 ℃恒溫暗培養[5]。種子萌發后，以胚根長達到或超過種子長度為標準記錄發芽數。每天統計發芽數，第3天統計發芽勢，第5天測量幼苗根長和株高以及幼苗各部位鮮質量、干質量，第7天統計發芽率。

發芽勢=第3天發芽種子數/試驗種子總數×100%；

發芽率=第7天發芽總粒數/試驗種子總數×100%；

發芽指數=在第7天內每天種子發芽數/相對應的種子發芽天數的發芽總和；

活力指數=發芽指數×幼苗鮮質量；

出苗率=子葉完全展開的幼苗數/供試種子數×100%。

1.2.3 細胞膜透性測定 取不同輻照處理的凈種子各20粒，用蒸餾水沖洗3次，再用四蒸水沖洗2次。將清洗過的種子放入潔凈的100 mL三角瓶中，加入四蒸水60 mL，于25 ℃下浸泡24 h，用精密電導率儀測定浸出液的電導率(C1)，再將種子及浸出液100 ℃水浴30 min，冷卻至25 ℃后測定總電導率(C2)[6-7]。

相對電導率=(C1-C0)/(C2-C0)×100%。

式中：C0為四蒸水的電導率。

1.2.4 用葉絲浸提法[8]測定子葉葉綠素含量 用小刀和直尺切取1 cm2子葉葉片，切成長約5 mm、寬約1 mm的細絲，投入5 mL 80%丙酮的刻度試管中，封管口于暗中提取至細絲完全變白為止。分別在663、645 nm處讀取提取液的吸光度D，所用公式為：

葉綠素a(Chl a)含量=12.7D663 nm-2.69D645 nm；

葉綠素b(Chl b)含量=22.9D645 nm-4.86D663 nm；

葉綠素總含量(CV)=Chl a含量+Chl b含量；

CA=0.5CV/S。

式中：CA為單位面積的葉綠素含量；S為用于提取葉綠素的葉面積。

1.2.5 半致死劑量(LD50)計算 不同劑量輻照處理后的出苗率是確定輻射損傷效應的重要指標，是計算半致死劑量的依據，半致死劑量是輻射育種適宜誘變劑量的參考[9]。處理種子的出苗率為對照出苗率50%的輻射劑量即為半致死劑量。

2 結果與分析

2.1 輻照處理對黃瓜種子萌發的影響

不同的輻照劑量對黃瓜種子萌發的影響不同，具體結果如圖1所示。當輻照劑量為50 Gy(處理2)時，其發芽勢、發芽率、發芽指數、活力指數這4項發芽指標均高于對照和其他各輻照處理，分別比對照增加7.47%、4.96%、13.84%、27.04%，特別是發芽指數和活力指數這2項指標明顯大幅提高，種子發芽時間短，發芽速度快，發芽整齊度高。當輻照劑量為100～880 Gy時，隨著輻照劑量的增加，黃瓜種子發芽進程明顯延遲，其發芽勢、發芽率，發芽指數、活力指數明顯下降，而且劑量越高，下降越明顯；當輻照劑量為1 000 Gy(處理8)時，其發芽勢、發芽率、發芽指數、活力指數只有對照的58.33%、48.86%、43.51%、12.81%，輻射損傷效應明顯。

2.2 輻照處理對黃瓜種子細胞膜透性的影響

輻照處理不僅能引起細胞核中DNA產生變異，同時還會引起膜損傷，膜透性會明顯改變，表現出種子浸出液電導率改變，對輻照處理后黃瓜種子 24 h 浸出液電導率及相對電導率測定結果見圖2。當輻照劑量為50 Gy(處理2)，2種電導率均低于未輻照處理，說明細胞膜透性小于對照，細胞膜未受到輻射損傷；當輻照劑量為255～880 Gy時，細胞滲出液濃度隨著輻照劑量的加大而增加，電導率越大，膜透性越大，細胞受損傷程度越大；當輻照劑量為1 000 Gy時，24 h電導率、相對電導率分別為23.92 μS/cm、29.78%，分別是對照的1.927、2.009倍。黃瓜種子的24 h電導率和相對電導率變化趨勢一致。

2.3 輻照處理對黃瓜幼苗子葉葉綠素含量的影響

對苗齡為5 d的黃瓜幼苗，于08：00取樣，測其子葉葉綠素含量，結果見圖3。從圖3可知，當輻照劑量為50 Gy(處理2)時，其子葉葉綠素含量為0.232 mg/dm2，高于對照和其他各處理。處理3以后，隨著輻照劑量的增加，子葉葉綠素含量直線下降，到1 000 Gy(處理8)時，葉綠素含量僅為 0.153 mg/dm2，比對照減少29.49%，幼苗葉綠素合成受到嚴重影響，植株葉面散生條狀黃斑。

2.4 輻照處理對黃瓜幼苗生長的影響

對第5天的幼苗，每處理取6株，考察幼苗的生長情況，測定根長和株高，其結果如圖4所示。由圖4可知，不同的輻照劑量對黃瓜幼苗根系生長影響不同。當輻照劑量為50 Gy(處理2)時，幼苗平均根長為 3.4 cm，較對照增加0.3 cm，側根發生多，根系生長快。當輻照劑量為100～880 Gy時，隨著輻照劑量的增加，受輻照種子的幼苗根系生長明顯受到抑制，且劑量越大，抑制效果越明顯，側根發生也受到抑制。當輻照劑量為1 000 Gy時，絕大多數幼苗只有1條主根，平均根長只有0.8 cm，側根很少發生。

由圖4還可知輻照處理對黃瓜幼苗株高的影響與根系相似，當輻照劑量為50 Gy時，幼苗株高為 4.6 cm，高于對照0.4 cm，也高于其他各輻照處理。當輻照劑量為 880 Gy(處理7)、1 000 Gy(處理8)時，株高明顯較其他處理低，只有1.1、0.6 cm，分別比對照低3.1、3.6 cm，子葉生長緩慢，且其上散生條狀黃斑。

2.5 輻照處理對黃瓜幼苗各部位鮮質量、干質量和干質量/鮮質量值的影響

考察第5天的黃瓜幼苗植株各部位的鮮質量、干質量以及干質量/鮮質量值，結果如表1所示。子葉的鮮質量以處理2最高，平均每株為0.099 3 g，比對照增加0.014 7 g，處理3以后隨著輻照劑量的增加，子葉的鮮質量逐漸下降，至處理8時每株子葉鮮質量只有0.030 2 g，僅為對照的35.70%。下胚軸、根系的鮮質量隨著輻照劑量的變化情況與子葉相似。

表1 輻照處理對黃瓜幼苗各部位鮮質量、干質量及干/鮮比值的影響

注：測定的各部位數值指平均每株黃瓜幼苗鮮質量和干質量。

子葉、下胚軸、根系3個部位的干質量表現一致，也是處理2最高，處理3以后隨著輻照劑量的增加，3個部位的干質量明顯下降，劑量越大，下降越明顯。

值得注意的是子葉、下胚軸、根系3個部位的干質量/鮮質量值，當輻照劑量為50 Gy時，3個部位的干質量/鮮質量值分別為 0.141 0、0.136 4、0.109 4，均高于對照，3個部位的鮮質量、干質量也高于對照，可見黃瓜種子經50 Gy輻照處理以后，幼苗各部位在增加鮮質量的同時，還使干質量有相應的增加，說明不單是細胞含水量增加。當輻照劑量為100～1 000 Gy時，隨著輻照劑量的增加，子葉、下胚軸、根系的干質量/鮮質量值明顯上升，有的處理還遠遠超過對照，這是由于不同劑量的輻照處理使幼苗根系生長受到抑制，根系吸收能力較弱，子葉、下胚軸的生長受到抑制，有機物合成受到影響，各部位鮮質量、干質量低于對照。因此，這種較高的干質量/鮮質量值并不代表植株生長加強，而只是生長受抑制的表現。

2.6 黃瓜干種子輻射處理的半致死劑量

植物種子輻射當代的出苗率是確定輻射損傷效應的重要指標，是計算半致死劑量的依據。黃瓜種子的出苗率是指子葉完全展開的幼苗數占供試種子數的百分比。半致死劑量是輻射育種的適宜劑量。以輻照劑量0、100、255、500、675、880、1 000 Gy 為自變量(x)，相對應的出苗率36.80%、30.63%、26.32%、22.13%、19.27%、17.67%、16.22%為因變量(y，%)，進行回歸計算，得a=36.21，b=-0.018 7，直線方程式為y=33.27-0.018 7x。將對照出苗率的50%代入方程式，得LD50=795 Gy。

3 討論

在一定的劑量范圍內，輻射能促進植物種子萌發和幼苗生長。王天龍等研究發現，輻射劑量為 20～60 Gy 時有利于蘿卜種子發芽，輻射劑量為 60～150 Gy 時有利于其幼苗根的生長[10]。陳桂松等用低劑量γ射線輻照黃瓜風干種子，發現 4.28 Gy 輻照劑量處理可明顯刺激黃瓜增產[11]。本研究發現，當輻照劑量為50 Gy時，黃瓜種子的發芽勢、發芽率、發芽指數、活力指數4項發芽指標均高于對照，促進了黃瓜種子的萌發；第5天的黃瓜幼苗單位面積葉綠素含量高于對照和其他各輻照處理，有利于黃瓜幼苗有機物的合成；50 Gy輻照處理能促進幼苗根系生長，根長最長，側根發生多，有利于幼苗對水分和養分的吸收；50 Gy輻照處理能增加幼苗子葉、下胚軸、根系3個部位的鮮質量和干質量及干質量/鮮質量值，從而提高幼苗素質。

輻射處理后種子的發芽情況是衡量輻射損傷的重要指標之一。敖妍等發現，對扶芳藤種子輻射后，其發芽率受到的抑制與輻射劑量呈極顯著負相關[12]。葛維亞等研究表明60Co-γ輻射處理明顯不利于地被菊種子的萌發[13]。在本試驗中，當輻射劑量≥100 Gy時，輻射處理對黃瓜種子的萌發具有明顯的抑制作用，隨著輻照劑量的增加，種子的發芽勢、發芽率、發芽指數和活力指數明顯下降，輻照抑制了種子的萌發，其原因可能是輻射對種胚結構及萌發過程的生理活動產生了不同程度的影響。

輻射處理對幼苗生長的抑制作用，也是衡量輻射生物學效應的一個重要指標。從本研究對黃瓜種子輻射處理結果來看，100～1 000 Gy的輻射處理對幼苗生長抑制明顯，隨輻照劑量的增加，第5天的黃瓜幼苗子葉葉綠素含量逐漸下降，幼苗株高逐漸變矮，根長逐漸變短，子葉、根系及下胚軸生長明顯受到抑制，輻照劑量為1 000 Gy時，幼苗生長緩慢，株高最矮，大部分幼苗只有1條主根，側根很少發生，部分種子雖然能正常發芽，但不能出苗或出苗后逐漸死亡。本試驗中還發現，當輻照劑量高于100 Gy時，幼苗的鮮質量、干質量與輻照劑量呈負相關，其原因可能是輻射處理抑制了幼苗根系生長，根系吸收能力較弱，下胚軸和子葉生長受到抑制，有機物合成受到影響。但干質量/鮮質量值與輻照劑量呈正相關，但這并不代表幼苗生長的加強，而只是生長受到抑制的表現。

輻射誘變首先要確定適宜的輻射劑量，才可能獲得有益的突變，一般都以半致死劑量作為輻射育種的適宜輻射劑量。耿興敏等在研究60Co-γ射線輻射對桂花種子萌發及幼苗生長影響時，以輻射處理后桂花品種的發芽率計算半致死劑量，且還發現高劑量輻射后種子雖能萌發，但出苗率受到明顯的抑制[14]。熊秋芳等研究發現，低劑量的輻射不會影響蘿卜種子的最終發芽率，卻抑制了出苗率，且隨著輻射劑量的增大，其抑制作用變明顯，主要表現為抑制了根莖生長[15]。本研究發現，≥100 Gy輻射劑量處理的黃瓜種子的發芽率與出苗率存在較大差異，部分種子雖然能發芽，但最終未能出苗，以發芽率計算的半致死劑量高于以出苗率計算的半致死劑量，較高的輻射劑量會增加畸變率，從而降低有益突變體的產生。

4 結論

本試驗結果表明，60Co-γ射線對黃瓜種子的輻射效應明顯。當輻照劑量為50 Gy時，輻射能明顯促進黃瓜種子萌發，促進幼苗生長和提高幼苗素質。當輻照劑量為100～1 000 Gy 時，種子發芽率等4項發芽指標、幼苗子葉葉綠素含量、幼苗生長量、幼苗各部位的鮮質量和干質量隨輻照劑量的增加而明顯下降，而種子細胞膜透性和幼苗各部位干質量/鮮質量值隨著輻照劑量的增加而加大，說明輻射能明顯抑制黃瓜種子萌發和幼苗生長。經計算，黃瓜種子輻射誘變的半致死劑量為795 Gy。