雜交玉米品種家佳榮2號種子純度的InDel分子標記鑒定

姚宗澤， 李 陽， 郭宗娟， 張思親， 胡 曉， 趙自仙

(1.云南農業大學農學與生物技術學院，云南昆明 650201； 2.杭州中軟安人網絡通信股份有限公司，浙江杭州 310012；3.普洱市瀾滄縣東河鄉農業服務中心，云南普洱 665628)

玉米作為世界三大糧食作物之一，集飼用、能源以及食用于一體。因此保障玉米生產穩定發展、促進玉米產量穩步提升，對我國的社會穩定和人民生活水平的維持在很大程度上都有著一定的促進作用。

種子純度是衡量種子質量的重要指標[1]，種子純度一直以來都是世界各國關注的主要問題，種子純度的鑒定在種子生產、銷售以及大田種植過程中至關重要。種子純度鑒定技術涉及的知識面較廣、技術性強、新問題多。常用方法有種子形態鑒定、幼苗鑒定、物理鑒定、化學鑒定、田間小區種植鑒定等[2]。自1974年Grodzicker等發明了限制性片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism，簡稱RFLP)技術[3]以來，隨著科學技術的不斷進步，人們對分子標記的認識也在不斷地深入，目前已有很多種分子標記為人們所知，其中一部分已被運用于種子純度鑒定中，如RFLP技術、隨機擴增多態性DNA(random amplified polymorphism DNA，簡稱RAPD)標記、簡單重復序列(simple sequence repeats，簡稱SSR)標記、插入缺失標記(insertion-deletion，簡稱InDel)、基于SNP(單核苷酸多態性)的分子標記等[4]，傳統的農作物純度鑒定方法正在受到快速發展中的分子標記技術的挑戰。本研究介紹了田間小區種植鑒定和InDel標記在品種純度鑒定中的應用。田間小區種植鑒定是將種子樣品按照要求種植到田間(大田或溫室)，根據幼苗和植株的形態鑒定純度的方法[5]，它以某一品種典型性狀表現最為明顯的時期作為最佳判定時期，在這段時間內以該品種的形態特點和農藝性狀作為判定種子真偽的標準。田間小區種植鑒定能夠觀測整個植株的生長發育過程，觀測員可以隨時觀測小區內所有植株的生長情況，并將它們的農藝性狀記錄下來，鑒定結果比較準確、可靠，適用于對雜交種的判定，能成為種子貿易中仲裁鑒定和賠償損失的依據，是目前植物品種真實性檢驗和純度鑒定中比較有效的手段。但其缺點也比較明顯，由于該方法主要根據品種的表型差異進行判定，對工作人員的專業技術要求高，在不同環境下種植以及反季種植會造成品種特征特性發生變化，受環境影響較大，且鑒定周期長、成本高、易受季節限制、用地多、工作量大，影響了種子質量檢測、監督的速度和質量[6]。InDel是一種新型分子標記，它指的是2個親本之間全基因組中所存在的差異，這種差異具體表現為一個親本相較于另一個親本而言，全基因組中因核苷酸的插入或缺失而存在一定的區別。在實際操作中，依據插入缺失位點兩端的保守序列設計引物，通過PCR擴增、電泳等操作，可以對基因組間存在這種差異的樣品進行區分。與以往的分子標記相比，在不同品種玉米基因組分型的應用中，InDel標記有著更多的優勢，Vroh等研究發現，在玉米全基因組中平均每 309 bp 就會有1個InDel標記的存在，數量遠多于植物基因組中的SSR標記[7-8]。胡俏強等利用篩選出來的5對InDel引物成功完成了對4個糯玉米雜交種純度的鑒定工作，且鑒定結果與田間小區種植鑒定結果呈極顯著正相關，故InDel標記在作物品種純度鑒定中具有一定的可靠性[9]。張錄霞等利用2對InDel標記也完成了對2個新疆主栽番茄雜交種純度的快速鑒定工作[10]。

本研究以優良雜交玉米品種家佳榮2號為供試材料，先后利用田間小區種植鑒定和InDel分子標記來完成對同一批家佳榮2號種子純度的鑒定工作，構建家佳榮2號種子純度鑒定技術體系，為規模化種子純度鑒定奠定基礎，有利于種子質量控制和該品種的大面積推廣應用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗材料包括雜交種家佳榮2號及其父母本、JR02雜交組合，共4份。JR02是玉米新組合，其母本與家佳榮2號的母本互為姊妹系，可用于人為摻假鑒定，以驗證篩選出引物的可靠性。本試驗用的種子均由隨機抽樣所得。本試驗中的18對InDel引物[11](表1)是由前人從玉米模式生物B73全基因組中篩選出來的多態性較高的引物。引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

表1 InDel引物序列和編號

1.2 田間小區種植鑒定

田間小區種植試驗在尋甸縣大河橋云南農業大學育種基地(地理位置25°31′07″E，103°16′41″N，海拔1 864 m)進行。2015年5月21日，將家佳榮2號雜交種子播種到準備好的肥力一致的田塊中，試驗地塊肥力中等，前作無玉米種植。小區行長3 m，行距0.75 m，穴播，穴距0.42 m。根據種子檢驗技術規程和國家種子質量標準[13]，玉米大田用種的種子純度要求達到96.0%以上，種植株數為400/(100-96)，即100株以上。試驗播種方式為單粒點播，綜合考慮試驗要求及實際成本，共播150粒家佳榮2號雜交種子。30 d后記錄出苗株數，逐株編號掛牌并剪取葉片，單獨保存，作為室內DNA提取材料。每穴的栽培和管理措施均一致，管理同一般大田生產，玉米生長前期不定苗、不間苗，但及時防蟲防病。在田間于玉米開花期和成熟期及時調查玉米生育特性及各個單株的農藝性狀。

1.3 InDel分子標記鑒定

1.3.1 材料DNA的提取 將4份材料在室內進行沙培，到 3～5葉期，剪取葉片，采用Saghai-Maroof等于1984年提出的CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法[12]提取DNA，單獨提取田間采集的家佳榮2號樣品總DNA，用于室內雜交種子純度鑒定，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的DNA。

1.3.2 InDel的PCR擴增 PCR反應體系見表2，反應程序設置見表3。InDel分子標記的PCR反應體系配置的整個操作過程均在冰上完成，體系配好后，加入25 μL礦物油，以防止PCR擴增過程中反應液受熱蒸發。

表2 PCR反應體系

表3 PCR擴增程序

1.3.3 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 制膠程序如下：先清洗玻璃板并組裝電泳槽，凝膠的配制按表4的配方進行，然后用灌膠瓶將膠注入2片玻璃板之間，再把梳子緩慢插入。

表4 8%非變性聚丙烯酰胺膠配方

電泳：待凝膠完全凝固后，將1×TBE倒入膠槽中，中間倒入量需淹沒短玻璃板，兩邊倒入量為槽高度的1/3即可，緩慢平穩地拔出梳子。將電泳槽接上電源，電壓設為220 V，電流為180 mA，功率為50 W，進行預電泳10 min。預電泳結束后，將儀器暫停。點樣量按2 μL marker、4 μL樣品進行設置。點樣完成后啟動儀器，繼續電泳1.0～1.5 h。

銀染：電泳完成后，先將膠在銀染液中染色 10 min，再移至顯影液中顯影，待完全顯影，用去離子水對膠進行數次清洗，再將膠放于光照儀上進行拍照記錄。

1.4 指紋圖譜的構建及數字化處理

從膠圖中挑選出雙親間具有多態性的引物進行指紋圖譜的構建，然后根據同一引物與母本、父本、雜交種結合擴增所得DNA片段在膠圖中同一位置的表型來進行記錄。對于同一遷移位置，若有條帶則記為1，無條帶則記為0，按照此規則來對所得指紋圖譜進行數字化處理。然后按照公式P=1/2n(n為用于構建指紋圖譜的引物共檢測出等位基因的數目)來計算所構建的指紋圖譜無法區分家佳榮2號與其他品種的概率[13]。

1.5 種子純度鑒定

根據雙親條帶互補且均不同于雜交種的規則，從構建的指紋圖譜中篩出合適的引物來對供試樣品進行純度鑒定。然后依據InDel分子標記的聚丙烯酰胺凝膠電泳結果，按照樣品電泳條帶是否與雙親的電泳條帶互補來判定該樣品的類型。當樣品電泳條帶與某一親本的電泳條帶位置一致時，判定該樣品為此親本的自交系；當樣品的電泳條帶位置既不同于某一親本的位置，又不同于雙親互補的位置時，判定該樣品為異品種；當雙親條帶所處位置均有樣品條帶與之對應時，則判定該樣品為雙親的雜交種。

品種純度的百分率按下面公式進行計算：

將計算所得結果與農作物種子質量標準中的玉米指標進行比對，本試驗所用材料為玉米單交種家佳榮2號。容許差距按以下公式進行計算：

式中：p表示標準規定純度，%；q表示理論計算的最大允許的雜株數，q=100%-p，%；N表示種植株數或樣品數量。

所以應將計算所得品種純度的數值與“96%-T=93.3%”進行對比。

1.6 摻雜驗證InDel方法的可靠性

提取雜交種JR02的DNA，然后隨機選用2對篩選出的適用于家佳榮2號純度鑒定的InDel引物對其進行擴增，再進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，與雜交種家佳榮2號及其親本產物進行對比。

2 結果與分析

2.1 田間小區種植鑒定結果

玉米家佳榮2號于2015年7月23日抽雄，7月25日抽絲，第1次鑒定時間為7月26日，共鑒定了137株，異形株數為0。第2次于2015年10月3日鑒定，根據穗形、籽粒顏色、粒刺的有無、長短、粒型并結合果穗大小等農藝性狀進行鑒定，共鑒定137株，異形株有3株，純度為(137-3)/137×100%=97.8%，鑒定結果以成熟期鑒定結果即第2次鑒定結果為準。

2.2 玉米雜交種家佳榮2號及其親本的DNA提取檢測結果

瓊脂糖電泳檢測，結果表明，采用Saghai-Maroof等于1984年提出的CTAB法[12]所提取的DNA都完整，可繼續使用。

2.3 InDel引物分析

本試驗利用18對InDel引物對雜交玉米品種家佳榮2號及其親本DNA進行PCR擴增和電泳檢測，18對引物全部擴增出了清晰、穩定的條帶。在這18對InDel引物中，有11對引物檢測結果顯示親本之間有著較好的多態性，其余7對引物(P1、P6、P8、P10、P11、P12、P18)檢測的位點不存在多態性，多態性檢測率為61%。再將雜交種家佳榮2號的電泳圖譜與雙親進行對比，得到偏父本型引物1對(P3)，沒有偏母本型引物(圖1)。

2.4 InDel引物指紋圖譜的構建及數字化處理

選取雙親間具有多態性的11對InDel引物構建家佳榮2號的指紋圖譜，11對引物共檢測出了40個等位基因，然后將11對InDel引物的擴增片段進行數字化處理，如表5所示，40個數字組成了家佳榮2號的指紋圖譜，即在理論上，若想培育出另一個玉米新品種，其在這40個等位基因的數字序號與家佳榮2號一致的概率為9.09×10-13。

2.5 家佳榮2號純度鑒定引物篩選

參照圖1，按照能夠清晰穩定區分家佳榮2號及其父母本的原則，從18對InDel引物中篩選出適用于家佳榮2號純度鑒定的引物(表6)。

2.6 InDel分子標記鑒定結果

從10對InDel引物中隨機選取2對引物對同一批樣品的137個供試樣品進行純度鑒定。如表7所示，引物P9檢測出了4株雜株，雜株樣品編號分別為64、85、131、138，檢測純度為97.1%；引物P13檢測出了6株雜株，雜株樣品編號分別為64、67、85、131、136、138，檢測純度為95.6%。綜合2對引物的檢測結果，137個供試樣品中不是家佳榮2號的共有6個，供試樣品純度為95.6%。2對InDel引物均成功把雜株鑒定出來，說明InDel分子標記的鑒定結果可靠。

2.7 摻雜驗證

由圖2可得，選用的2對InDel引物中，P9清晰穩定地區分出了摻雜品種與家佳榮2號及其親本，而P13則并未能鑒定出JR02。

3 討論與結論

品種純度作為種子重要的質量指標，檢測方法有很多種。其中田間小區種植鑒定法一直是檢測品種是否保持特有農藝性狀或符合種子指令標準要求的重要手段之一[14]，但田間小區種植鑒定對人力物力需求較多，周期較長，對自然環境以及檢驗員均有著較高要求[15]。室內分子標記技術因具備操作簡便、周期短、環境因素要求低、可重復性好等優點而深受國內外學者的重視[16]。近10年以來，隨著人們對分子標記技術的認知以及運用不斷深入，國家也頒布了一些根據不同類型分子標記的原理而進行品種鑒定的行業標準[17]，本研究在前人研究的基礎上，對同一批供試樣品的鑒定結果進行反復驗證。本試驗先通過田間小區種植鑒定對供試材料進行品種純度的鑒定，然后在室內進行DNA提取，再用InDel分子標記技術對供試樣品的純度進行反復的驗證。其檢測結果與田間小區種植鑒定的檢測結果有一定的差異，田間小區種植鑒定的檢測結果高于InDel分子標記技術的檢測結果。有可能是由于個別雜株在形態特征和生育特性上的差異在田間不易被辨別，被錯誤地判定為真實品種所所造成的。

表5 基于InDel分子標記的家佳榮2號及其親本數字化指紋圖譜

表6 適用于家佳榮2號純度鑒定的引物

表7 InDel分子標記鑒定家佳榮2號品種純度結果

本試驗采用田間小區種植鑒定和InDel分子標記技術對玉米雜交種家佳榮2號的同一批供試樣品種子純度進行反復檢驗和驗證， 同時構建了家佳榮2號的指紋圖譜，并從中篩選出適合家佳榮2號純度鑒定的引物。主要研究結果：(1)利用田間小區種植鑒定法，家佳榮2號的種子純度為97.8%；InDel分子標記技術方法鑒定結果為95.6%，InDel的結果略低于田間小區種植鑒定結果。(2)18對InDel引物中能與家佳榮2號雙親基因組穩定結合且具有多態性的引物共有11對，多態性檢測率為61%。通過檢測，其中10對InDel引物都能與家佳榮2號穩定結合，可用于鑒定家佳榮2號的種子純度。(3)在10對引物中隨機選取2對引物(P9、P13)，以JR02為摻雜品種，有1對引物(P9)能從家佳榮2號中區分出JR02，但P13無法區分家佳榮2號和JR02。(4)18對InDel引物從前人以玉米模式生物B73全基因組序列信息為背景開發出來的引物中篩選而來，表明利用B73全基因組序列信息進行玉米分子標記探索具有較高的可信度。