草甘膦對黑斑蛙主要器官中抗氧化酶的影響

高愛保

(晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山西晉中 030600)

草甘膦，化學(xué)名為N-(磷酸甲基)甘氨酸，不溶于有機(jī)溶劑，極性很強(qiáng)，易溶于水，它是一種非選擇性、無殘留、內(nèi)吸傳導(dǎo)型廣譜滅生性除草劑。雖然草甘膦對動物的毒性很低，但由于其消耗量過大、施用范圍廣，還可能通過食物鏈富集，因此其毒性不可忽視。一方面，它們可直接進(jìn)入人和其他生物的體內(nèi)，引起急性、慢性中毒或畸變；另一方面，通過徑流、排污、揮發(fā)等途徑進(jìn)入土壤、水體和大氣，引起各種生態(tài)環(huán)境下生物的死亡，并通過食物鏈的富集、傳遞，影響人類的食品安全[1]。這些污染物進(jìn)入生物體內(nèi)，可形成多種中間產(chǎn)物，其中許多中間產(chǎn)物可進(jìn)入氧化還原循環(huán)，產(chǎn)生比母體污染物危害性更大的中間代謝產(chǎn)物，同時伴隨著大量的活性氧自由基的產(chǎn)生[2]。這些活性氧自由基若不及時清除，就會引起DNA斷裂、脂質(zhì)過氧化、酶失活等損傷[3]，對機(jī)體造成氧化脅迫。目前，國內(nèi)對草甘膦的毒性研究已有不少報道。2007年，肖永紅等在草甘膦對中華大蟾蜍的慢性毒性的研究中發(fā)現(xiàn)，亞致死劑量的草甘膦溶液對中華大蟾蜍蝌蚪的生長、發(fā)育和運(yùn)動頻率有抑制作用[4]。2010年，張彬彬研究的草甘膦對鯽魚肝臟內(nèi)膜系統(tǒng)和超氧化物歧化酶的影響表明，隨草甘膦質(zhì)量濃度增加，干細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)中線粒體腫脹及空泡化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡化，不同質(zhì)量濃度的草甘膦處理對鯽魚肝臟中超氧化物歧化酶(SOD)均起誘導(dǎo)作用，SOD活性隨污染物質(zhì)量濃度升高而升高，96 h處理SOD活性先被誘導(dǎo)，而后出現(xiàn)抑制效應(yīng)[5]。

黑斑蛙(Rananigromaculata)是無尾目、蛙科、蛙屬的兩棲動物，成蛙常棲息于池溏、水溝邊等近水域附近的草叢中。近年來，兩棲類動物在全球范圍內(nèi)出現(xiàn)了嚴(yán)重的種群衰退現(xiàn)象，尤其是農(nóng)藥和除草劑使用后的負(fù)面影響已引起人們的重視[6-7]。同時，草甘膦對環(huán)境及有益生物的影響受到關(guān)注[8-9]。兩棲類動物是生態(tài)群落的重要組成部分，因此它們的消亡和滅絕將會對生物多樣性產(chǎn)生巨大的威脅。近年，隨著環(huán)境污染的日益加重，兩棲動物種類在世界各地正在急劇地衰減或消失[10]。國內(nèi)外許多學(xué)者報道了常見殺蟲劑和除草劑對兩棲類的毒性及對兩棲類種群衰退的影響，他們對常見的兩棲類物種不明原因地衰減或消失進(jìn)行了多次論證，認(rèn)為兩棲動物由于其皮膚的高滲透性、水陸兩棲等生物學(xué)特性，對環(huán)境污染極其敏感，兩棲動物種群的變化與環(huán)境污染物有密切的關(guān)系[11-13]。本試驗用不同濃度的草甘膦研究其在不同時間內(nèi)對黑斑蛙的肝臟、腎臟和皮膚中SOD活性及過氧化氫酶(CAT)活性的影響，了解草甘膦對其抗氧化系統(tǒng)的毒害，從而為合理使用草甘膦、保障生物多樣性和提高生物安全性提供初步的試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

健康成年黑斑蛙平均體長為(74.5±4.5) mm，隨機(jī)均分為對照組和染毒組，放在室內(nèi)盛有3～5 cm 不同體積分?jǐn)?shù)的草甘膦(41%草甘膦異丙胺鹽水劑，南京華洲藥業(yè)有限公司)溶液的小桶內(nèi)養(yǎng)殖，對照組溶液為飲用水，每天更換1/2溶液，且投喂1次。試驗組分為5個處理，每個處理3次重復(fù)，其體積分?jǐn)?shù)梯度為0.82、1.23、1.64、2.05、2.87 mL/L；定時觀察記錄黑斑蛙外形及生理變化。

1.2 試驗方法

每隔10 d以雙毀髓法處死，取其皮膚、肝臟和腎臟測定超氧化物歧化酶(SOD)活力和過氧化氫酶(CAT)活性，并記錄試驗數(shù)據(jù)，采用SPSS進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 草甘膦對黑斑蛙肝臟中SOD活性的影響

由圖1可知，不同體積分?jǐn)?shù)草甘膦處理后黑斑蛙肝臟中SOD活性發(fā)生變化，與對照組相比呈先增高后降低的趨勢。10 d時，對照組肝臟中SOD活性與0.82、1.23 mL/L組無顯著差異。SOD最高值33.35出現(xiàn)于2.87 mL/L組，其余體積分?jǐn)?shù)組與對照組相比差異顯著(P<0.05)。20、30 d對照組肝臟中SOD活性均與處理組有顯著差異(P<0.05)。30 d處理SOD活性升高后，為降低，草甘膦體積分?jǐn)?shù)為2.05 mL/L時，SOD活性出現(xiàn)最高值，為33.808 U/mg。

2.2 草甘膦對黑斑蛙腎臟中SOD活性的影響

由圖2可知，不同體積分?jǐn)?shù)草甘膦處理后，黑斑蛙腎臟中SOD活性變化。10 d時，腎臟SOD活性與對照相比，除最低體積分?jǐn)?shù)0.82 mL/L組外，其他組均差異顯著(P<0.05)。20、30 d時，所有處理組與對照組相比均有顯著差異(P<0.05)。SOD活性最大值33.29 U/mg出現(xiàn)于2.05 mL/L處理 20 d 時。

2.3 草甘膦對黑斑蛙皮膚中SOD活性的影響

由圖3可知，不同體積分?jǐn)?shù)草甘膦處理后，黑斑蛙皮膚中SOD活性變化。10 d時，腎臟SOD活性僅2.05 mL/L組與對照組有顯著性差異(P<0.05)。在2.05 mL/L時，10、20 d所有處理與對照組均有顯著差異(P<0.05)。SOD活性最大值 38.708 U/mg 出現(xiàn)于2.05 mL/L處理10 d時。

2.4 草甘膦對黑斑蛙肝臟中CAT活性的影響

由圖4可知，不同體積分?jǐn)?shù)草甘膦處理后，黑斑蛙肝臟中CAT活性與對照組相比有先增高后降低的趨勢；肝臟中CAT活性與對照組相比均顯著升高(P<0.05)，但不同體積分?jǐn)?shù)草甘膦對CAT活性間差異不顯著。CAT最低值4.49 mg/(g·min)出現(xiàn)在 0.82 mL/L 處理10 d時，最高值4.52 mg/(g·min)出現(xiàn)在1.64 mL/L處理 30 d時。

2.5 草甘膦對黑斑蛙腎臟中CAT活性的影響

由圖5可知，經(jīng)過不同體積分?jǐn)?shù)草甘膦處理后，黑斑蛙腎臟中CAT活性與對照組相比較有升高的趨勢。處理10、20、30 d時，腎臟CAT活性與對照組比較差異顯著(P<0.05)，表明草甘膦處理后CAT活性發(fā)生了顯著變化，從而對抗氧化損傷壓力。CAT活性最低值1.81 mg/(g·min)出現(xiàn)在0.82 mL/L處理 10 d 時，最高值2.22 mg/(g·min)出現(xiàn)在1.64 mL/L處理30 d時。

2.6 草甘膦對黑斑蛙皮膚中CAT活性時影響

由圖6可見，經(jīng)過不同體積分?jǐn)?shù)草甘膦處理后，黑斑蛙皮膚中CAT活性與對照組相比較有升高的趨勢，處理10、20、30 d時各體積分?jǐn)?shù)組皮膚CAT活性與對照組比較差異顯著(P<0.05)，尤其是 2.87 mL/L 體積分?jǐn)?shù)處理組，與對照差異極顯著(P<0.01)，表明草甘膦處理后皮膚中CAT活性很快發(fā)生顯著變化，從而對抗氧化損傷壓力。處理組CAT活性最低值 6.098 mg/(g·min) 出現(xiàn)在 0.82 mL/L 處理10 d時，最高值 10.728 mg/(g·min) 出現(xiàn)在1.64 mL/L處理 30 d 時。

3 討論

近年來，除草劑草甘膦的使用所帶來的危害已經(jīng)引起越來越多的人的關(guān)注，而本身它作為一種潛在的生態(tài)危險源，已經(jīng)被眾多研究者探究，兩棲類動物種群的消失與農(nóng)藥的使用有一定的相關(guān)性。草甘膦對植物的毒性作用機(jī)理被認(rèn)為是低風(fēng)險的除草劑，因此對它的使用得到了推廣，使用量也逐年增加。但農(nóng)藥的使用不可能全部被雜草吸收，隨著雨水的沖刷、液體的蒸發(fā)，使得部分草甘膦殘留在土壤、大氣以及水域系統(tǒng)中，這樣再加上時間的積累、食物鏈的富集，有可能同樣會威脅到人類的生存和健康。

在生物的抗氧化系統(tǒng)中，SOD和CAT均是重要的抗氧化劑。在草甘膦染毒后，組織中的SOD活性和CAT活性被誘導(dǎo)，不同體積分?jǐn)?shù)的草甘膦溶液隨著染毒時間延長，SOD活性和CAT活性總體呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢，這與張彬彬研究的草甘膦對鯽魚肝臟內(nèi)膜系統(tǒng)和超氧化物歧化酶活性的影響的結(jié)果[5]相似，但在1.64～2.87 mL/L體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，0～20 d內(nèi)SOD活性和CAT活性均增強(qiáng)，而在20～30 d 內(nèi)其活性則在減弱，表現(xiàn)出劑量效應(yīng)和時間效應(yīng)，即隨時間延長，出現(xiàn)氧化損傷加大、毒害程度加深的現(xiàn)象，并且在不同組織器官中差異顯著，皮膚裸露在外，短時間就能作出反饋，而腎臟中反應(yīng)相對滯后，因而SOD、CAT活性具有組織特異性。從本試驗的結(jié)果可知，除草劑草甘膦對黑斑蛙具有一定的危害性，草甘膦對成年黑斑蛙的安全使用體積分?jǐn)?shù)為1.64 mL/L。而農(nóng)業(yè)上除草時使用的濃度均高于這一濃度，會使超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性受到抑制。

由于除草劑具有選擇毒性，對天敵的致死率與殺蟲劑相比普遍較低，因此人們以往并不太關(guān)注除草劑對天敵動物的影響，但實(shí)際上，農(nóng)業(yè)耕作過程中所施用的除草劑僅有少部分被植物吸收，大部分被噴施在與作物同一生境的動物體表或殘留在土壤和水體中，對水體和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)造成污染[14-15]。盡管草甘膦在被噴施到水體環(huán)境中時濃度會被水體有所稀釋，但水面蒸發(fā)以及草甘膦積累可導(dǎo)致水環(huán)境中草甘膦濃度升高，即使按照草甘膦的常用濃度施用，也將會對黑斑蛙造成不同程度的危害。從本研究中黑斑蛙的生長狀況來看，低體積分?jǐn)?shù)草甘膦的使用可提高它的活躍性和運(yùn)動頻率；高體積分?jǐn)?shù)的草甘膦使得它的生長緩慢、運(yùn)動遲緩；但隨著染毒時間延長，不論草甘膦為低體積分?jǐn)?shù)還是高體積分?jǐn)?shù)，都會導(dǎo)致黑斑蛙生長緩慢、運(yùn)動遲緩。