干燥溫度及生長年限對黔產青錢柳質量的影響

王 維， 葉世蕓， 殷少文， 鄭立肯

(貴州中醫藥大學，貴州貴陽 550000)

青錢柳[Cyclocaryapaliurus(Batal.) Iljinskaja]系胡桃科青錢柳屬，是我國特有的高大速生闊葉多用途喬木[1]，于冰川世紀保存至今，是國家重點保護的瀕危植物之一。據《中國中藥資源志要》記載，其葉具有清熱解毒、止痛、治療頑癬等功能[2]，其根、莖、枝均可入藥。青錢柳目前以保健茶的形式出現在大眾視野中。青錢柳茶是以初春嫩葉為原料，經過炒制而成的[3]。茶飲氣清香、色澤呈紅棕色、味甘甜，具有生津止渴、清熱解暑的功效，特別適宜現代“三高”類慢性疾病人群飲用[4]。雖然青錢柳葉一直被當作茶來飲用，但青錢柳并不屬于普通食品范疇，到2013年青錢柳葉被正式批準為新食品原料，可以作為普通食品食用，因此有關青錢柳茶的基礎性研究也需隨之加強。

現代研究表明，從青錢柳中已分離獲得的成分主要有多糖類、三萜類、黃酮類、酚酸類和無機元素類等[5]。青錢柳多糖具有降血脂[6-7]、降血糖[8]、降血壓[9]、免疫調節[10-12]等作用。青錢柳中總三萜[13-14]包括熊果酸、齊墩果酸、科羅素酸等，具有減輕β胰島細胞的損傷和抑制其凋亡[15]、促進小鼠胚胎成纖維細胞對葡萄糖的消耗、調節酪氨酸蛋白的磷酸化平衡[16-19]等作用。青錢柳黃酮類化合物具有抗氧化、增強心血管的作用，能降低“三高”發病率[20-21]等。由此可見，青錢柳的保健功能是有效物質群多靶點的共同作用結果。

本研究同時測定樣品中的多糖、總三萜、槲皮素、山柰素含量，以確定青錢柳的最佳干燥溫度和適宜的生長年限，為青錢柳的產業化種植、產地加工、產品開發提供理論依據[22]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀，購自安捷倫科技(中國)有限公司；Agilent C18柱(規格：250 mm×4.6 mm，5 μm，型號PN880975-902)，購自北京國譜科技有限公司；UV-2501PC紫外光譜儀，購自日本島津公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋，購自金壇市晶玻實驗儀器廠；KQ-100E超聲波清洗器，購自昆山市超聲儀器有限公司；TDL-5A低速自動平衡離心機，購自湖南星科科學儀器有限公司；101-1A電熱鼓風干燥箱，購自天津天泰儀器有限公司；XS205電子天平，購自瑞士梅特勒-托利多儀器(中國)有限公司。

槲皮素對照品(批號：20160322)、山柰素對照品(批號：20160113)、齊墩果酸對照品(批號：20160511)、D-無水葡萄糖標準品(批號：20151119)，購自上海金穗生物科技有限公司；色譜級甲醇(批號：20130410)，購自天津市科密歐化學試劑有限公司；香草醛(批號：20150305)，購自上海譜振生物科技有限公司；苯酚(批號：20150604)，購自國藥集團化學試劑有限公司；濃硫酸(批號：20130101)，購自川東化工集團。

1.2 試樣來源和預處理

樣品采自黔東南苗族侗族自治州劍河縣雷山鎮八萬山林場(108.58°E、26.64°N)的不同生長年限的青錢柳。經貴陽中醫學院葉世蕓教授鑒定為胡桃科青錢柳屬青錢柳。葉片除雜后，分別在陰干(25 ℃)及60、70、80、90、100 ℃條件下干燥(其水分含量約為4.0%)，打粉，過60目篩備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 多糖含量測定方法 通過正交試驗設計和全波段掃描，確定樣品多糖含量的測定方法：稱取適量青錢柳供試品，用石油醚進行脫脂處理后，加80%乙醇回流2 h，殘渣用無水乙醇洗滌后抽濾，濾液用Sevage法除蛋白，加入無水乙醇過夜醇沉，離心。棄上清液，沉淀依次用95%乙醇、無水乙醇、乙醚、丙酮各洗滌2次，殘渣干燥至恒質量，即為青錢柳多糖。取青錢柳多糖和D-無水葡萄糖標準品，加蒸餾水分別配制濃度為0.15 mg/mL的青錢柳多糖溶液和1.001 mg/mLD-無水葡萄糖標準品溶液。取青錢柳試樣2.0 g，精確稱量，置于圓底燒瓶中，加入80%乙醇50 mL，在90 ℃水浴回流1 h，趁熱抽濾，濾渣中加入80 mL蒸餾水，于90 ℃水浴回流 1 h，趁熱抽濾，濾液使用離心機于常溫、5 000 r/min離心10 min，上清液用蒸餾水定容至500 mL。取上述多糖溶液、D-無水葡萄糖溶液和供試品溶液各 2 mL，分別置于10 mL容量瓶中，各加0.6 mL苯酚與5 mL 98%硫酸，在100 ℃水中顯色 20 min，冷卻至室溫，在488 nm處測定其吸光度。測得青錢柳多糖與D-無水葡萄糖間的換算因子f=2.654。根據吸光度和換算因子，計算供試品中多糖含量。

1.3.2 總三萜含量測定方法 通過正交試驗設計和全波段掃描，確定樣品中總三萜含量的測定方法：取適量脫脂的青錢柳供試品，精確稱量，加70%乙醇溶液25 mL，超聲提取60 min，取續濾液和齊墩果酸標準品各0.2 mL，分別置于10 mL試管中，蒸干后各加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸溶液0.8 mL，在60 ℃水浴中加熱15 min，取出冷卻后加入4 mL冰醋酸，用70%乙醇定容至 10 mL，在546.5 nm處測定其吸光度。以齊墩果酸計，計算樣品中總三萜含量。

1.3.3 槲皮素和山柰素含量測定方法 通過正交試驗設計和全波段掃描，確定樣品中槲皮素和山柰素含量的測定方法：精確稱量適量青錢柳供試品，加入80%甲醇50 mL，加熱回流1 h，冷卻，用80%甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，精確量取續濾液25 mL，精確加入37.5%鹽酸4 mL后置90 ℃水浴中加熱水解 1 h，取出，迅速冷卻，轉移至50 mL容量瓶中，用80%甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾，用Agilent C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，在流動相為甲醇 ∶0.4%磷酸(65 ∶35)、進樣量10 μL、流速1 mL/min、檢測波長360 nm的色譜條件下，以槲皮素和山柰素為標準品，測定樣品中的含量。

1.3.4 方法學考察 以“1.3.1”“1.3.2”“1.3.3”節的優化條件處理樣品，進行方法學考察，結果見表1，上述3種測定過程中， 樣品在一定時間范圍內穩定，儀器精密度良好，重現性高，樣品中待測物質與儀器響應值呈良好的線性關系，加樣回收符合測定要求，所以方法穩定、可行。

表1 青錢柳中多糖、總三萜、槲皮素、山柰素測定的方法學考察

注：x為濃度，y為峰面積。測定波長同“1.3”節。

2 結果與分析

根據“1.3.1”“1.3.2”“1.3.3”節的方法，測定不同干燥溫度和不同生長年限下的青錢柳樣品中多糖、總三萜、槲皮素、山柰素的含量，結果見表2。

表2 青錢柳樣品中多糖、總三萜、槲皮素、山柰素含量的測定結果

表2(續)

對青錢柳中的多糖、總三萜、槲皮素、山柰素4種成分進行主成分分析。根據主成分分析的原理[23]，結合特征值和累計貢獻率，考慮到更為全面地評價干燥溫度和生長年限對青錢柳質量的影響，選擇前2個主成分，方差累計貢獻率達 83.028%，其特征值分別為2.335、0.987，結果見表3。

表3 主成分總方差分析

根據主成分系數矩陣(表4)，2個主成分的線性擬合方程為

F1=0.348X1-0.071X2+0.371X3+0.406X4；

F2=0.104X1+0.998X2+0.008X3+0.078X4。

表4 主成分系數矩陣

由于所測得的4個指標可以由F1和F2進行評價，對2個主成分線性擬合中的系數作加權平均，對指標權重進行歸一化處理，得綜合評分模型如下，結果見表5。

F=0.252X1+0.225X2+0.241X3+0.282X4。

通過對綜合評分進行方差分析，生長年限F=8.721，P=0.000<0.05，干燥溫度F=17.106，P=0.000<0.05，兩者對結果有顯著影響，結果見表6。

結合綜合得分排序，80 ℃時，各生長年限下的青錢柳綜合得分最高。在80 ℃條件下，7年生的綜合得分最高。

在青錢柳的產地加工研究過程中，生長年限較短的青錢柳，葉片薄而色澤淺，用傳統的炒茶機容易加工成型，成品外觀性狀佳；而生長年限較長的青錢柳，葉片厚而色澤深，在加工過程中，葉片容易碎裂，成品性狀較差[24]。在干燥的過程，溫度過低，干燥所需要的時間較長，會造成葉片顏色加深及有效成分降低，并且效率低下，不適合工業化生產，而高溫會使葉片炭化，破壞有效成分。通過本研究，得出最佳的干燥溫度是80 ℃，最佳的生長年限為7年。

3 討論

在以往青錢柳相關的研究中，都是以一個指標性成分或一類有效物質進行其質量的評價，本研究通過正交試驗設計，優選確定了青錢柳樣品處理條件和測定方法。對60批不同干燥溫度和不同生長年限下的青錢柳進行多糖、總三萜、槲皮素、山柰素指標的含量測定，全面確定青錢柳最佳的生長年限和最優的炮制工藝。

通過查閱相關文獻，青錢柳的采收期已有研究報道[25]，而產地加工及生長年限對其品質的影響無研究報道。本試驗對黔產青錢柳中多糖、總三萜、槲皮素、山柰素含量進行主成分分析并結合隨機區組的試驗方差分析，確定青錢柳的最佳干燥溫度為80 ℃，生長年限在7年左右為宜。

表5 青錢柳樣品主成分因子及品質綜合得分

表5(續)

表6 綜合評分的方差分析結果

4 結論

青錢柳是我國重點保護的瀕危植物之一，具有很高的開發應用價值。但是，現有的青錢柳資源主要是天然林，不僅數量少，而且多零星分布于深山老林和一些自然保護區中[26-27]。目前，青錢柳葉的主要食用方式是制成茶，其制法和飲法都與綠茶類似，人們從20世紀八九十年代開始就以青錢柳葉為原料制成了系列茶產品，其銷售額呈現逐年增加的趨勢。但青錢柳茶實質上為單純的水浸出劑，雖能將青錢柳葉中的大部分多糖溶出，但不能將其中三萜、黃酮等其他對人體有益的有效成分溶出，由此造成大量原材料的浪費。隨著青錢柳茶市場份額的不斷擴大，缺乏統一的產品標準，無法客觀評價青錢柳茶的質量，制約了其后續開發利用。

現今，貴州省建立了青錢柳種植基地，通過對該基地的考察可知，當地的采收季節為清明節前后，此時葉片較為柔軟，容易加工，成品性狀較佳，但加工方式也只有簡單的傳統炒茶機，沒有對溫度的控制。由于設備簡單，造成了大量稀有資源的浪費。本研究成果可以用于指導青錢柳加工設備關鍵參數的設置及幼苗移栽后的最佳采摘年限，并可為以青錢柳為原料的特醫食品、保健食品的開發提供技術指導，最大程度地保留青錢柳的有效物質基礎，確保其保健功能。

為了改變青錢柳茶市場混亂的局面，出臺青錢柳的地方或行業標準勢在必行，這就需要以青錢柳的前期基礎研究作為依據，利用多指標綜合評價青錢柳，制定質量標準，同時為黔產青錢柳資源科學合理的開發利用提供參考[28]。本研究采用主成分分析法，客觀分析黔產青錢柳生長年限、采摘時間、炮制工藝、提取方法等幾個方面對其質量的影響，以期為黔產青錢柳提供更多發展可能，在初制產品基礎上向提取保健成分與開發保健食品、化妝品、藥品延伸，向中成藥多樣化、天然飲料、天然食品、天然療養、體驗、休閑旅游等方面發展。既可提高青錢柳產業的效益，又橫縱向拓展了該產業空間，拓寬了視野，開拓了思路，營造了良好的發展氛圍，實現資源共享，有利于最大限度地開發利用青錢柳[29]。