一例豬偽狂犬病病原的鑒定

黃宇翔，張 軍，王志強，鄒 躍，陳 亮，吳憲，候美如

（黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院 161005）

豬偽狂犬病( Porcine pseudorabies，PR)是由ɑ 皰疹病毒引起的多種家畜和野生動物感染的一種急性傳染病。 除豬以外的其他動物發病后表現為發熱、奇癢、腦脊髓炎等癥狀。 該病危害各階段的豬，新生仔豬常出現神經癥狀、腹瀉、嘔吐、生長不良等臨床表現，死亡率高達100%；成年母豬和公豬多表現為繁殖障礙以及呼吸道癥狀，給世界多國養豬業造成重大經濟損失。 歐美等一些發達國家，已經根除了此病。 我國也在制定根除計劃，但近年來我國多省份仍有該病的報道， 嚴重影響和危害我國養豬業發展。 本試驗從發病仔豬中分離鑒定一株豬偽狂犬病毒，為豬偽狂犬病流行病學調查、 疫苗的研發以及致病機理的研究提供重要的幫助。

1 材料和方法

1.1 病料及試驗動物

病料 2017 年齊齊哈爾郊區某豬場發生懷孕母豬流產，3～5 日齡仔豬出現嘔吐、腹瀉，并伴有神精癥狀。 剖檢死亡仔豬，采取腦、淋巴結、肝、肺等組織。

試驗動物 6 周齡BALB/c 小鼠，由哈藥生物疫苗有限公司提供。

1.2 試劑及細胞

TIANamp virus DNA/RNA kit 購于OMEGA 公司； 高GC 含量PCR 擴增試劑盒購于生工生物工程（上海）股份有限公司；瓊脂糖購于TaKaRa 公司。 DMEM 培養基，購于GIBCO 公司；優級胎牛血清，購于天津市灝洋生物制品科技有限公司；Vero 細胞由哈爾濱獸醫研究所提供。

1.3 病料采集及處理

收集疑似患有PR 的仔豬的腦或淋巴結等組織， 通過無菌的條件下取約1.0g 的組織樣品，加入2.0mL 無菌生理鹽水，在組織均質破碎儀中處理30s， 將其放置-80℃反復凍融3 次， 隨后4℃條件下12000r/min 離心10min；取200μL 上清液用于組織中病毒DNA 的提取，或取上清液經過0.22μm 濾膜過濾后，分裝保存于-80℃冰箱保存，用于病毒分離。

1.4 PCR 檢測

應用DNA 提取試劑盒提取樣品病毒核酸， 并進行PCR 反應試驗。 參照文獻[1]以PRV 主要毒力基gE 基因序列設計引物進行PCR 擴增， 基因 片 段長為217bp。 引物F1：CACGGAGGAGGAGCTGGGGCT；F2：GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT， 由 上海生工生物工程公司合成。PCR 反應程序：94℃預變性5min；94℃變性40s，63℃退火1min，72℃延伸1min，30 個循環；72℃延伸10min。 產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 病毒的分離

將PCR 檢測結果為陽性的組織樣品處理后，取1.0mL 濾過液接種于生長良好單層的Vero 細胞，37℃條件下吸附1h， 棄接種液，加入含2%胎牛血清的DMEM 培養基，置37℃，5%CO2培養箱中培養，如未出現病變盲傳幾代，待細胞80%發生病變時終止培養，反復凍融3 次后，收集病毒液，置于-80℃保存。

1.6 病毒半數感染量（TCID50）測定

取病毒液，用無血清的DMEM 培養液作10 倍系列稀釋，將稀釋度為10－1～10－10 的病毒液按100μL/孔接種到長成單層細胞的96 孔細胞培養板上，每個稀釋度接種8 孔，同時培養板最后兩列接種DMEM 作為對照。 連續4d 觀察細胞病變情況，判定結果，按照Reed－Muench 法計算病毒的TCID50。

1.7 動物試驗

試驗分兩組，每組各5 只6 周齡BALB/c 小鼠，一組用200 TCID50稀釋毒經腹股溝皮下進行注射，接種量為0.5mL/只。 另一組接種等量的PBS 液作為陰性對照。 每天觀察和記錄小鼠的臨床癥狀和死亡情況。

2 結果

2.1 病毒培養結果

病料處理液接種Vero 細胞連續傳代培養后， 出現了明顯的細胞病變，18h 細胞開始變圓，42h 細胞圓縮，聚集，脫落（見圖2），60h 細胞嚴重脫落。

圖1 病料組織感染vero 細胞產生細胞病變（10×40）

2.2 TCID50 測定結果

根據分離病毒不同滴度接種Vero 細胞后出現的細胞病變情況，利用Reed-Muench 法進行毒價TCID50測定，結果TCID50＝10-8.1/0.1mL(見表1)。

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2.3 PCR 檢測結果動物試驗結果

按TIANamp virus DNA/RNA kit 操作說明以病毒培養液為樣本提取病毒DNA，以此為模板進行PCR 擴增，結果，可見清析的目的條帶（見圖2）。

圖2 PCR 檢測結果

2.4 動物試驗結果

BALB/c 小鼠接種該病毒液后出現了典型的PR 癥狀：發病的小鼠啃咬接種部位， 嚴重的皮膚出血， 皮毛脫落， 接種120h后，病毒接種組全部死亡。 對照組小鼠無異常變化。

3 討論

試驗從疑似豬偽狂犬病毒感染的病料中分離到一株病毒，經vero 細胞傳代培養， 出現了明顯細胞圓縮等特征性病變；經PCR 試驗檢測到特異性目的條帶；動物試驗出現了典型的PR 癥狀，這與文獻報道一致[2～3]。 以上結果證明此次分離的病毒為豬偽狂犬病毒強毒株。 該豬場一直用進口Bartha k61 弱毒疫苗進行免疫，但是偽狂犬病發生后仍然造成了流產率驟然上升、仔豬腹瀉和神經癥狀，死亡率較高。 經典毒株疫苗是否已經難以抵抗新流行毒株發病還需進一步研究。 該分離毒株可為豬偽狂犬流行病學研究和新型疫苗研發提供有用的生物材料， 對于控制我國豬偽狂犬病的流行具有重要意義。