用Micro-CT評價大鼠骨質疏松合并骨性關節炎模型

巫旭娜 許碧蓮 田佳 吳迪生 古劍雄

(1廣東醫科大學藥學院，廣東 湛江 524023；2東莞市第八人民醫院藥劑科；3廣東醫科大學附屬醫院)

骨質疏松(OP)是一種以低骨量和骨組織微結構退化為特征的進行性系統性骨骼疾病，最終導致骨質脆性增加和易于骨折〔1〕。OP可發生于不同年齡和性別，但多見于絕經后婦女。骨性關節炎(OA)是一種以關節軟骨退化、關節邊緣和軟骨下骨增生，繼而導致關節間隙狹窄為特征的關節慢性退行性疾病〔2〕。OA在中老年人中有較高的發病率，女性多于男性，特別多見于絕經后婦女〔3〕。OP與OA雖各自有著不同的病理變化和病因，但都屬于與年齡、性別有關的退行性病變，且絕經后婦女多見。全世界60%的絕經后婦女面臨著這兩大疾病的威脅〔4〕。因此，如何防治絕經后婦女的OP和OA，是人們亟待解決的問題。然而，在當前的基礎實驗研究中缺少穩定的OP合并OA的實驗動物模型。適合的實驗動物模型是作為大規模實驗研究的基礎，多年以來國內外報道了多種動物模型，然而各種模型的研究仍有待深入〔5，6〕。微計算機斷層掃描技術(Micro-CT)是一種非破壞性的三維(3D)成像技術，可以在不破壞樣本的情況下清楚了解樣本的內部顯微結構。本實驗采用兩側去卵巢(OVX)和膝關節腔中注射碘乙酸鈉(MIA)兩種方法相結合建立大鼠OP合并OA模型，并通過Micro-CT來確認評價，為臨床上研究OP合并OA提供實驗研究基礎。

1 材料與方法

1.1動物及藥品 18只3月齡雌性SD大鼠，購自廣西醫科大學實驗動物中心(合格證號：SCXK桂2014-0002)，平均體重(246±22)g。適應性飼養1個月，開始實驗時平均體重為(300±15)g。MIA購自美國Sigma公司(批號：19148)，viva Micro-CT 40(SCANCO Medical AG，瑞士)。

1.2動物分組及模型制備 18只大鼠隨機分為假手術(Sham)組、兩側OVX組、兩側OVX+MIA組，每組6只。大鼠OVX手術在無菌條件下進行，采用戊巴比妥鈉25 mg/kg行腹腔注射麻醉，先行背部雙側腰椎旁1.5 cm處，縱行切口進入腹腔，除假手術組僅暴露卵巢不切除，其余組大鼠切除兩側卵巢，結扎卵巢動脈依次縫合肌肉層和皮膚制作OVX的OP模型〔7〕。4 w后在無菌條件下，又用戊巴比妥鈉25 mg/kg進行腹腔注射麻醉，用醫用酒精消毒關節附近的鼠毛和皮膚，Sham和OVX組大鼠于右膝髕骨下韌帶處于關節腔內注入無菌生理鹽水50 μl，而OVX+MIA組大鼠用同樣的方法于右膝關節腔中注入配制好的MIA溶液50 μl〔8〕。12 w后，將大鼠麻醉并進行心臟取血處死，取右側股骨和脛骨并用生理鹽水紗布和錫紙包裹，于-80℃保存備用。

1.3股骨松質骨Micro-CT測量 解凍右側股骨，將標本垂直固定于固定器內，使標本骨骺端保持一致的方向，每6個標本放置一層，進行Micro-CT掃描。viva CT40選擇的掃描參數：圖像矩陣：2 048×2 048×223，整合時間：200 ms，能量/強度：70 kVp、114 μA、8 W，CT值以1 200 mg HA/cm進行校正，0°旋轉掃描。掃描完成后，對股骨松質骨分析是從縱切面距離生長板遠端1.0 mm處開始、共層厚3.0 mm的松質骨為測量區域進行重組獲得3D圖像，圖像信息為最低閾值170。對骨組織重組的圖像進行數據定量分析，可得到以下定量參數值：骨密度(BMD)、連接密度(Conn.D.)、結構模型指數(SMI)、骨體積分數(BV/TV)、骨小梁數量(Tb.N)和骨小梁分離度(Tb.Sp)。

1.4脛骨關節面軟骨micro-CT測量 解凍右側脛骨，在脛骨近心端1/3處用低速鋸沿著橫切面鋸斷，獲得脛骨上段，保留脛骨中段。將脛骨上段關節面浸泡于泛影葡胺顯影液，水浴鍋加熱至37℃，恒溫浸泡20 min取出。將一根脛骨垂直固定于固定器內，放入合適的掃描管內，viva CT40選擇掃描參數：圖像矩陣為2 048×2 048×223，整合時間：200 ms，能量/強度：45 kVp、177 μA、8 W，CT值以1 200 mg HA/cm校正，0°旋轉，進行掃描。掃描完成后，對骨組織重組圖像進行3D旋轉，以確保橫向軸與垂直軸對齊，進行定量分析內側關節面軟骨厚度時選取以正中心前后各2.0 mm，共層厚4.0 mm的關節組織為測量區域進行重組三維圖像，圖像信息為最低閾值170。在對應的關節面測量區域下對軟骨層進行3D圖像重組。可獲得以下定量參數：軟骨體積、軟骨厚度。

1.5統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行統計分析。符合正態分布的數據，組間比較使用單因素方差分析，方差齊時采用LSD-t檢驗，方差不齊時采用TamhaneT2檢驗。

2 結 果

2.1各組股骨松質骨Micro-CT定量參數的變化 與Sham組比較，OVX組和OVX+MIA組BMD、BV/TV、Tb.N和Conn.D均明顯減小(P<0.01)，Tb.Sp和SMI均明顯增大(P<0.01)。見表1。

2.2各組股骨Micro-CT的二維(2D)和3D結構圖的變化 由圖1可見，Sham組大鼠股骨骨小梁連接和分布緊密，骨2D和3D結構完整；OVX和OVX+MIA組的骨小梁數目減少且出現骨小梁多部位缺失、骨2D和3D結構明顯破壞。

表1 各組股骨松質骨Micro-CT定量參數的變化

與Sham組比較:1)P<0.01

圖1 各組股骨松質骨Micro-CT的2D和3D結構

2.3各組脛骨關節面內側軟骨Micro-CT定量參數的變化 與Sham組比較，OVX+MIA組軟骨厚度、軟骨體積均明顯減小(P<0.05，P<0.01)，而OVX組軟骨厚度、軟骨體積均無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組脛骨關節面內側軟骨Micro-CT定量參數的變化

與Sham組比較:1)P<0.05,2)P<0.01

2.4大鼠脛骨關節面內側軟骨Micro-CT的軟骨厚度2D和3D結構圖的變化 脛骨內側軟骨Micro-CT的2D結構圖中軟骨層的綠色面積越大代表該區域軟骨厚度越厚，3D結構圖中紅色越深代表該區域軟骨厚度越厚。與Sham組比較，OVX+MIA組軟骨厚度明顯變薄，而OVX組大鼠軟骨厚度稍為變薄。見圖2。

圖2 各組脛骨內側軟骨Micro-CT的軟骨厚度2D及3D結構

3 討 論

Micro-CT 能夠在微米級分辨率下對硬組織進行3D形態定量分析，比2D體視學定量方法更準確、更科學、更全面反映硬組織包括骨在內的一些材料微觀結構，能獲得真正的各項同性的容積圖像，提高空間分辨率〔9〕。Micro-CT不能對軟組織如關節軟骨直接進行掃描，因為軟組織的X射線吸收率比較低。文獻報道〔10〕，應用泛影葡胺造影劑結合Micro-CT掃描的方法，從Micro-CT掃描圖像中不但能夠清晰地看到軟骨區域，還可以通過重建方法將軟骨整體形態以3D形式呈現出來，可以進行軟骨厚度和體積測量。

本研究結果提示，OVX+關節腔內注射MIA制備OP合并OA的大鼠模型是成功的，而單純OVX不能制備OP合并OA的大鼠模型。文獻報道〔11〕，單純OVX對關節軟骨結構和軟骨細胞數量沒有影響，單純OVX不能導致OA。但也有研究報道，單純OVX可導致OA〔12〕。雌激素水平對關節軟骨也有影響，在軟骨上有雌激素的受體，雌激素缺乏時會使軟骨發生退化〔13〕。因此，單純OVX制備OP合并OA的動物模型，還尚未得到一致的結果。

OVX模型是模擬絕經后OP的經典模型，關節腔內注射MIA是誘導OA常用的動物模型，本實驗采用OP模型和OA動物模型相結合的方法直接模擬絕經后婦女OP合并OA大鼠模型。大鼠去卵巢后，雌激素缺乏。雌激素缺乏導致OP的主要機制與多種炎癥因子有關包括白細胞介素(IL)-1、IL-6、IL-7、腫瘤壞死因子(TNF)-α和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，當雌激素缺乏時這些炎癥因子會分泌增加。這些細胞因子又會誘導破骨細胞形成和促進骨吸收〔14〕。另外，當雌激素缺乏時垂體-衍生促卵泡激素分泌增加，破骨細胞和它們前體具有促卵泡激素的受體，因此增強了破骨細胞的活性〔15〕。骨吸收增強，導致骨重建失衡，雖然耦聯骨形成增加，但骨吸收大于骨形成，從而導致OP。

MIA能導致軟骨基質的降解和軟骨細胞的凋亡〔16〕，引起軟骨的降解和丟失、軟骨基質的改變、滑膜炎癥等類似于人骨關節炎的病變〔17〕。MIA誘導的原代大鼠軟骨細胞凋亡主要與活性氧的產生及線粒體介導的 caspase-3活化有關〔18〕，但是其確切的機制尚未明確。本實驗結果顯示，采用切除大鼠兩側卵巢和膝關節腔中注射MIA制備OP合并OA模型是可行的，通過Micro-CT掃描重建進行評價是可靠的。這一模型為OP合并OA藥物防治研究提供基礎依據。