海南黎族與漢族持續(xù)性房顫老年患者CYP2C9*3基因多態(tài)性差異分析

白敏 陳向紅 郭照軍 陳磊 王超 吳曾繁

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，海南 海口 570311)

持續(xù)性房顫患者存在高血管栓塞的風(fēng)險(xiǎn)，臨床治療指南推薦持續(xù)性房顫患者口服華法林抗凝，并且臨床研究也證實(shí)華法林可有效預(yù)防持續(xù)性房顫患者的血栓形成及降低血管栓塞概率〔1〕。華法林會(huì)顯著影響體內(nèi)凝血-抗凝系統(tǒng)，目前臨床主要通過(guò)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比率(INR)進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)〔2〕。但在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，華法林臨床應(yīng)用劑量的個(gè)體差異較大，劑量很難用相對(duì)統(tǒng)一的藥代動(dòng)力學(xué)公式進(jìn)行計(jì)算。研究證實(shí)，以細(xì)胞色素P450酶(CYP)2C9*3為代表的某些基因多態(tài)性分布是造成華法林維持劑量個(gè)體差異的主要因素之一〔3，4〕。海南省是我國(guó)黎族居民聚集地區(qū)，使用華法林的持續(xù)性房顫黎族患者數(shù)量逐年上升，目前尚沒(méi)有臨床研究對(duì)黎族患者群體的CYP2C9*3多態(tài)性分布特點(diǎn)及對(duì)華法林維持劑量影響進(jìn)行評(píng)估，因此本研究對(duì)此進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 選取2017年1月至2018年12月于海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院住院就診的持續(xù)性房顫黎族患者100例作為研究組，其中男53例，女47例；年齡61～73歲，平均年齡(67.5±5.9)歲,平均病程(18.5±8.6)個(gè)月，體重指數(shù)(24.6±1.8)kg/m2。其中擴(kuò)張型心肌病11例，缺血性心臟病89例。同期選取醫(yī)院住院的持續(xù)性房顫漢族患者100例為對(duì)照組，其中男55例，女45例；年齡62～75歲，平均年齡(68.3±6.7)歲,平均病程(20.1±9.4)個(gè)月，體重指數(shù)(23.8±2.0)kg/m2。其中擴(kuò)張型心肌病10例，缺血性心臟病90例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床確診為持續(xù)性房顫；(2) 合并慢性心力衰竭，紐約心臟病學(xué)會(huì)(NYHA)分級(jí)為3～4級(jí)；(3)服用華法林達(dá)到穩(wěn)定劑量，平均每個(gè)月監(jiān)測(cè)1次INR。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有嚴(yán)重肝腎肺等重要臟器功能不全；(2)同時(shí)服用阿司匹林、胺碘酮、維生素K等影響華法林代謝藥物及影響CYP活性藥物；(3)罹患活動(dòng)性潰瘍、支氣管擴(kuò)張等出血性疾病；(4)罹患血液病、凝血系統(tǒng)障礙及甲狀腺功能異常等疾患。

本研究患者相互間均無(wú)血緣關(guān)系，且均對(duì)本研究知情，并自愿簽署知情同意書。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)。兩組患者年齡、性別比、病程、體重指數(shù)及原發(fā)疾病等方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2基礎(chǔ)信息采集 收集兩組患者主要基本信息，主要為：姓名、性別、民族、年齡、體重、吸煙狀況、診斷、INR、INR達(dá)標(biāo)時(shí)間、華法林平均日用量和達(dá)標(biāo)時(shí)華法林總用量、服藥時(shí)間及合并用藥、富含維生素K食物攝入情況等。華法林穩(wěn)定劑量計(jì)算公式為：實(shí)際華法林劑量/INR值。

1.3CYP2C9基因分型檢測(cè)

1.3.1基因組DNA提取 兩組患者均在入組后次日清晨空腹抽取肘靜脈外周血5 ml，置于乙二胺四乙酸(EDTA)-Na抗凝管中，加紅細(xì)胞裂解液搖晃5～6次，在室溫下放置10 min，獲得白細(xì)胞，應(yīng)用英國(guó)Crawley公司的DNA提取試劑盒提取樣本基因組DNA。提取DNA樣本成功后，置于-20℃冰箱保存待檢。

1.3.2擴(kuò)增阻滯突變體系-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(ARMS-PCR)基因分型 采用ARMS-PCR和DNA 直接測(cè)序技術(shù)對(duì)CYP2C9*3(1075A-C)基因進(jìn)行基因分型，根據(jù)既往參考文獻(xiàn)〔3〕合成引物序列為：正義鏈：5′-CATGCA AGACAGGAGCCAC-3′及反義鏈：5′-TTGGGAATG AGATAGTTTCTGAATT-3′，擴(kuò)增和測(cè)序引物為上海生工公司合成。PCR擴(kuò)增時(shí)以GAPDH為陽(yáng)性對(duì)照，擴(kuò)增條件PCR反應(yīng)體系為25 μl，其中10×PCR緩沖液12.5 μl、引物探針混合液6.5 μl、超純水4 μl、基因組DNA 2 μl。應(yīng)用美國(guó)安捷倫 Mx3000熒光定量PCR儀器進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，57℃復(fù)性0.5 min，60℃延伸0.5 min，30個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。

1.4華法林濃度測(cè)定 兩組患者入組后接受華法林口服治療，定期監(jiān)測(cè)INR，維系INR 1.35左右，此時(shí)采集患者的肘靜脈外周血5 ml，1 500 r/min離心5 min，將血漿轉(zhuǎn)移至專用離心管(型號(hào)：Nanosep 10K,購(gòu)自美國(guó)Pall公司)，在37℃水浴1 h后，2 400 r/min離心10 min，將離心后的200 μl超濾液中加入0.1 mol/L乙酸20 μl，震蕩30 s，再加入乙酸乙酯1 ml，震蕩2 min，再5 000 r/min離心5 min，取800 μl上清液在氮?dú)庀麓蹈桑偌尤?00 μl復(fù)溶液震蕩1 min后14 000 r/min高速離心10 min。最后將上清液轉(zhuǎn)移至進(jìn)色譜及質(zhì)譜條件色譜柱(Acquity UPLC BEH C18，50 mm×2.1 mm)檢測(cè)華法林濃度〔5〕。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。采用Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)群體代表性。不同基因型間華法林劑量比較均先進(jìn)行Levene方差齊性檢驗(yàn)。兩組間均數(shù)比較采用成組t檢驗(yàn)；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1CYP2C9*3(1075A-C)基因型頻率和等位基因頻率比較 研究組A/A與A/C基因型顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，C/C基因型顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；而研究組等位基因A頻率顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，C頻率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組CYP2C9*3(1075A-C)基因型及等位基因頻率比較〔n(%),n=100〕

2.2兩組不同基因型患者的血清華法林濃度比較 兩組不同基因型患者的血清華法林濃度均存在差異，均為A/A型最大(P<0.05)，而A/C型與C/C型無(wú)顯著差異(P>0.05)；研究組A/A基因型患者的血清華法林濃度顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，但兩組A/C與C/C基因型患者的血清華法林濃度沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.3兩組不同基因型患者華法林穩(wěn)定劑量比較 兩組不同基因型患者的華法林穩(wěn)定劑量均存在差異，均為A/A型最大(P<0.05)，而A/C型與C/C型無(wú)顯著差異(P>0.05)；研究組A/A基因型患者的華法林穩(wěn)定劑量顯著低于對(duì)照組(P=0.019)，但兩組A/C與C/C基因型患者的華法林穩(wěn)定劑量沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表3。

2.4研究組不同基因型患者華法林抗凝效果比較 不同基因型黎族持續(xù)性房顫患者的INR達(dá)標(biāo)時(shí)間、華法林平均日劑量及總劑量均存在差異，順序均為：A/A>A/C>C/C (P<0.05)。見(jiàn)表4。

表2 兩組不同基因型患者的血清華法林濃度比較

與A/A比較：1)P<0.05；表3同

表3 兩組不同基因型患者的華法林穩(wěn)定劑量比較

表4 研究組不同基因型患者華法林抗凝效果比較

3 討 論

隨著國(guó)內(nèi)冠心病、慢性心力衰竭、高血壓等心血管疾病發(fā)病率維持高水平，持續(xù)性房顫發(fā)生率也呈逐年增加趨勢(shì)〔6〕。華法林被公認(rèn)能有效預(yù)防房顫病人血栓形成，然而華法林臨床應(yīng)用的安全窗較小，劑量難以確定，即便定期監(jiān)測(cè)INR調(diào)整劑量，也易存在劑量不足或過(guò)量，進(jìn)而導(dǎo)致血栓或出血事件發(fā)生，至今理想的INR水平國(guó)內(nèi)外尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)〔7〕。近年來(lái)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)發(fā)展認(rèn)為，華法林穩(wěn)定劑量存在較大的族群個(gè)體差異主要原因是與華法林劑量維持相關(guān)的基因存在著遺傳多態(tài)性〔2，6〕。華法林的主要代謝酶，即CYP基因多態(tài)性是華法林遺傳藥理學(xué)研究的熱點(diǎn)，也是被認(rèn)為影響華法林劑量需求最主要的因素〔4〕。

CYP2C9主要存在于人體肝臟中，是目前研究最廣泛、最深入的一種CYP家族基因〔8〕。華法林主要通過(guò)CYP2C9基因編碼蛋白酶代謝，CYP2C9基因突變會(huì)導(dǎo)致該酶代謝活性發(fā)生改變，因此CYP2C9基因多態(tài)性能影響華法林穩(wěn)定劑量〔9〕。CYP2C9有多個(gè)的突變位點(diǎn)，目前對(duì)于基因多態(tài)性種族差異主要集中在CYP2C9*3等位基因，研究證實(shí)CYP2C9*3基因具有低華法林代謝活性，分別較CYP2C9-1純合子降低代謝活性80%左右〔10〕。因此與CYP2C9-1純合子相比，CYP2C9-3等位基因更容易增加出血的風(fēng)險(xiǎn)，達(dá)到同樣抗凝效果劑量需求則更低，達(dá)到穩(wěn)定的INR所需時(shí)間更長(zhǎng)。

不同種族之間CYP2C9*3等位基因發(fā)生頻率在的差異較大〔11〕，白種人的CYP2C9*3等位基因的發(fā)生頻率較高，為6%～10%，而亞洲人CYP2C9*3的頻率僅為1%～2%〔5〕。由此導(dǎo)致不同種族間華法林維持劑量存在顯著差異，黃種人平均維持劑量顯著低于白種人和黑種人〔12，13〕。國(guó)內(nèi)研究也顯示內(nèi)蒙古地區(qū)和南方地區(qū)人群的CYP2C9*3等位基因發(fā)生頻率存在差異，這也顯示國(guó)內(nèi)不同地區(qū)或民族的華法林維持劑量也存在差異〔14〕。

本研究顯示，罹患持續(xù)性房顫黎族患者的C/C基因型占優(yōu)勢(shì)，而漢族患者A/A與A/C基因型占優(yōu)勢(shì)，與此同時(shí)等位基因C頻率在持續(xù)性房顫黎族患者中占有顯著優(yōu)勢(shì)，而持續(xù)性房顫漢族患者中A頻率占優(yōu)勢(shì)，這提示等位基因C或CC基因型是持續(xù)性房顫黎族患者華法林穩(wěn)定劑量的相關(guān)基因，而AA基因型頻率在漢族人群中比率最高。A/A基因型持續(xù)性房顫黎族患者的華法林穩(wěn)定劑量及血清華法林濃度均高于A/C型與C/C型，這一點(diǎn)與對(duì)照組漢族A/A基因型患者也是最高相同，表明黎族與漢族C/C基因型或等位基因C患者華法林穩(wěn)定劑量及血清華法林濃度較低，發(fā)生出血性事件危險(xiǎn)均較小。同時(shí)研究也表明相同A/A基因型持續(xù)性房顫患者中，黎族患者華法林穩(wěn)定劑量及血清華法林濃度低于漢族，而A/C與C/C基因型則無(wú)差異，這顯示僅A/A基因型患者的華法林劑量及濃度存在族群差異，這值得臨床進(jìn)一步研究。C/C基因型黎族持續(xù)性房顫患者的INR達(dá)標(biāo)時(shí)間、華法林平均日劑量及總劑量最低，而且安全性較好，這也從臨床表現(xiàn)上分析證實(shí)C/C基因型或等位基因C會(huì)降低持續(xù)性房顫黎族患者華法林穩(wěn)定劑量及穩(wěn)態(tài)達(dá)標(biāo)時(shí)間。