基于光譜技術的維生素B12與大豆分離蛋白相互作用分析

李 楊 李明達 王中江 鄭 麗 滕 飛

(東北農業大學食品學院， 哈爾濱 150030)

0 引言

維生素B12又被稱為鈷胺素，是唯一含有金屬元素的水溶性維生素，也是B族中最晚發現的一種。作為一種重要的營養因子，維生素B12參與葉酸轉化、蛋氨酸合成等生化反應，維生素B12缺乏會導致惡性貧血和神經疾病等[1]。維生素B12的穩定性主要受到光、熱、溶液pH值的影響，在食品加工過程中常轉變為各種類似物[2]。根據《中國居民膳食營養素參考攝入量》[3]，成人維生素B12推薦攝取量為2.4 μg/d，該營養素人體自身不能合成，必須從食物中攝取，動物性產品(如魚或貝類、雞蛋、動物肝臟等)是其主要攝取源[4]。由于維生素B12易損失、不穩定，構建天然保護機制是防止其被破壞的最直接手段，也是高效利用維生素B12、開發強化食品、防止維生素B12缺乏癥的關鍵。

食品級蛋白質是生物活性化合物的潛在載體，大豆蛋白是目前唯一含有人體所需8種氨基酸、且含量滿足人體需求的植物蛋白，因其高營養價值和良好的消化性和功能性能(乳化性、凝膠性、起泡性等)而被廣泛應用于食品加工中[5]。同時，大豆蛋白分子肽鏈中含有豐富的疏水氨基酸殘基和帶電氨基酸殘基，可通過疏水相互作用、靜電作用和氫鍵作用等與水溶性營養成分結合，不僅能很好地傳遞和運載水溶性活性物質，還能夠提高營養成分的生物利用率，甚至可以提高蛋白的某些功能特性[6]。文獻[7]研究發現，熱處理的大豆蛋白與花青素通過疏水作用結合后，提高了蛋白的消化率。文獻[8]將大豆蛋白與葉酸復合制備納米凝膠，可使葉酸維持天然結構及生物活性，并在腸道環境中迅速釋放。文獻[9]研究發現，季銨鹽改性后的大豆蛋白與抗壞血酸復合，水溶性維生素表現出較高結合率，同時改善大豆蛋白的溶解性。

食品中的維生素B12以蛋白結合型存在，研究食源蛋白與維生素B12的相互作用對提高維生素B12穩定性至關重要。已有文獻對維生素B12與蛋白質的相互作用進行了研究。文獻[10]研究了維生素B12和牛血清白蛋白(BSA)復合物在不同pH值條件下的結合親和性，結果表明：維生素B12在酸性和堿性(pH值2.5、3.5、5.0和9.0)條件下與BSA的結合能力低于模擬生理條件(pH值 7.4)，并且相互作用使BSA的二級和三級結構發生了顯著的變化。文獻[11]通過熒光光譜法和紫外吸收光譜法研究了生理條件下維生素B12與牛血清白蛋白之間的相互作用，結果表明，維生素B12對牛血清白蛋白的熒光有猝滅作用，其猝滅過程屬于靜態猝滅并且二者的結合位點位于色氨酸附近。文獻[12]將乳清蛋白與維生素B12復合，維生素B12的光熱穩定性提高了10%～30%?？梢?，通過維生素B12與蛋白結合可提高維生素B12的穩定性，但具有代表性的食源蛋白(大豆分離蛋白)與維生素B12的相互作用研究尚未見相關報道。

本文利用光譜技術(熒光光譜、紫外光譜、紅外光譜、圓二色譜)研究大豆分離蛋白與維生素B12的相互作用對大豆分離蛋白結構的影響，以期為提高維生素B12穩定性、開發維生素B12營養強化食品提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫脫脂豆粕，山東禹王生態食業有限公司；維生素B12，美國Sigma試劑公司；氫氧化鈉、鹽酸等為國產分析純試劑。

1.2 儀器與設備

FD-1C型冷凍干燥機，北京德天佑科技發展有限公司；FJ-200型高速分散均質機，上海標本模型廠；LGR20-W型臺式高速冷凍離心機，北京京立離心機有限公司；F-4500型熒光分光光度計，日本HITACHI公司；TU-1800型紫外可見分光光度計。

1.3 試驗方法

1.3.1大豆分離蛋白制備

參照文獻[13]的方法并稍作修改，將低溫脫脂豆粕與去離子水按照液料比10 mL/g混合后，用2 mol/L NaOH溶液調pH 值至8.0，室溫(20℃)攪拌2 h后，溶液于9 000g離心30 min，取上清液用2 mol/L HCl溶液調pH 值至4.5。溶液靜置2 h后于7 500g離心30 min 得到蛋白沉淀，將蛋白沉淀溶于去離子水后洗滌3次，用2 mol/L NaOH調溶液的pH值至7.0。最后將蛋白溶液倒入平皿中冷凍干燥后得粉末狀大豆分離蛋白，儲藏備用。

1.3.2大豆分離蛋白-維生素B12復合物制備

參照文獻[12]的方法并稍作修改，取1.2 mg大豆分離蛋白溶于磷酸鹽緩沖溶液中(0.01 mol/L，pH值7.4)，配制質量濃度為12 mg/mL的大豆分離蛋白溶液，于4℃下儲存。取16 mg維生素B12溶于磷酸鹽緩沖溶液中(0.01 mol/L，pH值7.4)，配制質量濃度為0.4 mg/mL的維生素B12溶液，于4℃下儲存。將大豆分離蛋白溶液稀釋至300 μg/mL，分別與不同質量濃度的維生素B12(0、10、20、28、40、50 μg/mL)混合，室溫下黑暗攪拌1 h，得到大豆分離蛋白-維生素B12復合物。

1.3.3熒光光譜測定

參照文獻[14]的測定方法并稍作修改，大豆分離蛋白-維生素B12復合物的內源性熒光光譜采用F-4500型熒光分光光度計進行掃描。將復合物樣品用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH值7.4)配制成質量濃度為0.15 mg/mL的溶液。激發波長設定為290 nm，發散波長掃描范圍為300～500 nm，激發狹縫寬度為5 nm，發射狹縫寬度也為5 nm，掃描速度為240 nm/min。同步熒光光譜：室溫下，分別固定Δλ=15 nm和Δλ=60 nm，其中Δλ表示激發波長和發射波長彼此間保持固定的波長間隔。

1.3.4熒光猝滅機理

參照文獻[15]的測定方法并稍作修改，將大豆分離蛋白-維生素B12復合物樣品等分為3份，分別置于25、33、41℃的恒溫水浴鍋中保溫10 min，利用熒光光譜儀連續掃描并記錄測定樣品的熒光強度。光譜參數同上，重復掃描3次。

1.3.5紫外光譜測定

參照文獻[16]的測定方法并稍作修改，采用紫外分光光度計掃描大豆分離蛋白-維生素B12復合物的紫外光譜。用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH值7.4)將復合物樣品稀釋為0.15 mg/mL后，于室溫條件下進行紫外光譜掃描，掃描范圍250～350 nm，掃描速度為200 nm/min，分辨率為2 nm。

1.3.6紅外光譜測定

參照文獻[17]的測定方法并稍作修改，稱取大豆分離蛋白-維生素B12復合物1 mg，加入溴化鉀100 mg，充分混勻壓片后于室溫進行紅外光譜掃描。設定波譜的掃描范圍：400～4 000 cm-1，分辨率：4 cm-1，掃描64次，利用Peakfit 4.2.0軟件處理譜圖并通過積分面積計算各二級結構的相對含量。

1.3.7圓二色譜測定

將大豆分離蛋白-維生素B12復合物溶解在磷酸鹽緩沖溶液中，將蛋白質量濃度配制為0.5 mg/mL，將樣品溶液在190～250 nm遠紫外區進行掃描，掃描速度為 60 nm/min，分辨率為0.2 nm，響應時間為0.25 s，狹縫寬度為1 nm。使用CDpro軟件擬合蛋白質二級結構的組成與含量。

1.4 數據處理

圖表制作采用Origin Pro 8.5軟件，使用SPSS 19.0進行ANOVA差異顯著性分析和方差分析(P<0.05為顯著性差異)。每個試驗重復3次，結果表示為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 熒光光譜分析

大豆蛋白內部因含有不同的發色基團如色氨酸(Trp)，酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)而表現出內源熒光特性[18]。在激發波長為290 nm時，主要考慮色氨酸和酪氨酸。文獻[19]指出，蛋白的最大發射波長λmax與色氨酸等殘基所處的微環境密切相關，當最大發射波長λmax超過330 nm時，殘基處于外部極性環境中，相反，則表示殘基處于內部非極性環境。大豆分離蛋白與維生素B12復合體系的熒光光譜如圖1所示，當蛋白濃度固定時，隨著維生素B12添加量的增大，大豆分離蛋白的熒光強度逐步降低，說明維生素B12對大豆蛋白的內源熒光產生了猝滅作用。并且大豆分離蛋白的最大發射波長λmax由340.6 nm藍移至334.6 nm，藍移了6 nm，以上現象說明維生素B12與大豆分離蛋白發生了結合，使其構象發生了變化，色氨酸和酪氨酸的內部微環境也趨向改變，表現出一種由極性環境向非極性環境轉變的趨勢，可能是由于維生素B12與蛋白表面的親水性側鏈殘基相互作用，降低熒光強度，從而改變了色氨酸殘基的微環境[20]。文獻[21]在研究維生素B12與牛血清白蛋白(BSA)結合機理時也發現了最大發射波長藍移現象，可能的原因為維生素B12與牛血清白蛋白表面第134位的色氨酸殘基結合改變了其所處微環境的極性。而文獻[22]報道花青素與大豆分離蛋白結合后，蛋白的最大發射波長λmax發生紅移，肽鏈趨于伸展。這可能是由于維生素B12含有一個咕啉大環，分子量較大，結構復雜，與蛋白的結合方式不同，從而導致蛋白分子的結構變化差別較大。

圖1 不同維生素B12質量濃度下大豆分離蛋白與維生素B12復合體系的熒光光譜譜圖Fig.1 Fluorescence spectra of soybean protein isolate and vitamin B12 composite system

2.2 熒光猝滅機理

熒光猝滅機理一般可以分為靜態猝滅和動態猝滅兩種作用形式。靜態猝滅主要是指猝滅劑與熒光物質之間相互作用形成復合物而導致熒光強度下降，溫度升高后，猝滅常數(即Stern-Volmer曲線斜率)下降；動態猝滅則相反，主要是指猝滅劑與熒光物質間相互碰撞產生一定程度的電子轉移或能量轉移，導致熒光強度減弱，該過程與擴散效應相關，溫度上升促進了分子碰撞的劇烈程度，因此隨著溫度上升，動態猝滅常數增大[23]。根據Stern-Volmer方程[24]計算不同溫度條件下的猝滅常數，從而可以初步判斷該反應的熒光猝滅機制[25]為

(1)

式中F0——大豆分離蛋白中未加入猝滅劑(維生素B12)時的熒光強度

F——加入猝滅劑時的熒光強度

Kq——雙分子猝滅速率常數，L/(mol·s)

Ksv——猝滅常數，L/mol

Q——猝滅劑濃度，mol/L

τ0——無猝滅劑時生物大分子的平均熒光壽命，取10-8s

根據Stern-Volmer方程，以Q為自變量，以F0/F為因變量擬合一次函數方程，如圖2所示。曲線斜率代表猝滅常數Ksv，進一步求解可得Kq。

圖2 不同溫度條件下大豆分離蛋白與維生素B12復合物的Stern-Volmer曲線Fig.2 Stern-Volmer plots of SPI interacting with vitamin B12 at three temperatures

由圖2可知，Stern-Volmer方程的曲線斜率隨著溫度的上升而逐漸降低，可以推斷維生素B12對大豆分離蛋白的熒光猝滅機理屬于靜態猝滅，一般來說，各類猝滅劑對生物大分子的最大猝滅速率常數Kq為2×1010L/(mol·s)，而表1中維生素B12對大豆分離蛋白的熒光猝滅速率常數均大于2×1010L/(mol·s)，并且隨著溫度上升，Kq逐漸降低，更有力地證明了維生素B12對大豆分離蛋白的猝滅方式是由于維生素B12與大豆分離蛋白相互作用形成了基態配合物而引發了靜態猝滅[26]。

表1 維生素B12與大豆分離蛋白復合物的熒光猝滅速率常數、結合位點數、結合常數Tab.1 Fluorescence quenching constants, binding sites and apparent binding constants of vitamin B12-SPI complex

注：同列不同字母表示差異顯著，下同。

由圖2和表1已知維生素B12對大豆分離蛋白的猝滅機制為靜態猝滅，二者的結合常數Ka和結合位點數n滿足公式

(2)

圖3 不同溫度下維生素B12猝滅大豆分離蛋白的雙對數曲線Fig.3 Double logarithmic curves of vitamin B12 quenched soybean protein isolate at different temperatures

以lg((F0-F)/F)對lgQ作圖，不同溫度下維生素B12猝滅大豆分離蛋白的雙對數曲線如圖3所示。所得的曲線斜率為維生素B12與大豆分離蛋白的結合位點數n，將截距換算為結合常數Ka。根據表1數據顯示，維生素B12與大豆分離蛋白在298、306、314 K溫度下作用時，二者間的結合常數為4.121×105、1.256×105、1.806×105L/mol，表明二者存在較強的相互作用。并且維生素B12與大豆分離蛋白在3種不同溫度下的結合位點數都接近于1，說明維生素B12與大豆分離蛋白之間存在一個結合位點。文獻[21]證明了維生素B12與牛血清白蛋白也存在一個結合位點。

小分子物質與蛋白質之間的作用力主要為疏水作用力、靜電相互作用、氫鍵以及范德華力。通過Vant Hoff 方程，可計算出熱力學參數值。維生素B12與大豆分離蛋白之間的相互作用符合熱力學公式

(3)

ΔG=-RTlnKa=ΔH-TΔS

(4)

式中 ΔH——焓變，kJ/mol

ΔS——熵變，kJ/(mol·K)

ΔG——生成自由能變，kJ/mol

R——氣體常數，取8.314 J/(mol·K)

T——溫度，K

當溫度變化不大時，反應的ΔH可看作常數。

根據文獻[27]總結的小分子與生物大分子反應的熱力學參數變化判斷二者間主要作用力的類型規律：當ΔH>0且ΔS>0時，為疏水作用力；ΔH<0且ΔS<0時，為范德華力和氫鍵作用；ΔH<0且ΔS>0時，為靜電相互作用。

由表2可知，維生素B12與大豆分離蛋白的自由能變小于0，說明這是一個自由能降低的自發過程，ΔH<0且ΔS<0，表明維生素B12與大豆分離蛋白之間的主要作用力是范德華力和氫鍵。文獻[28]在研究花青素與小麥蛋白的相互作用機理發現，中性條件下黑豆皮中的花青素(矢車菊素-3-O-葡萄糖苷，C3G)與麥谷蛋白主要通過范德華力和氫鍵作用結合。

表2 維生素B12與大豆分離蛋白復合物的熱力學參數值Tab.2 Thermodynamic parameters of complex of vitamin B12 and soybean protein isolate

2.3 同步熒光光譜分析

同步熒光光譜通常應用于小分子和生物大分子相互作用的研究中，通過測量發射波長偏移研究對應氨基酸附近環境的極性情況從而反映小分子對生物大分子物質構象變化的影響[29]。通過將激發波長和發射波長之差Δλ固定在15 nm或60 nm，分別對大豆分離蛋白中的酪氨酸和色氨酸殘基周圍的極性變化進行分析[30]。

圖4 不同維生素B12質量濃度下大豆分離蛋白與維生素B12復合體系的同步熒光光譜Fig.4 Synchronous fluorescence spectra of soybean protein isolate and vitamin B12 complex system

維生素B12與大豆分離蛋白相互作用的同步熒光光譜如圖4所示，隨著維生素B12質量濃度的增加，酪氨酸殘基和色氨酸殘基的熒光強度逐漸降低，在Δλ=60 nm的情況下，同步熒光峰有輕微的藍移，從282 nm藍移至279 nm，而在Δλ=15 nm時，同步熒光峰無明顯移動，可判斷維生素B12對酪氨酸殘基的微環境無明顯改變，而色氨酸殘基所處的微環境疏水性增加，極性降低，表明維生素B12與大豆分離蛋白結合位點更接近于色氨酸殘基，推測可能的原因為維生素B12與大豆分離蛋白的相互作用可能誘導色氨酸附近的多肽鏈形成折疊，從而微環境疏水性進一步增加[21]。文獻[11]在研究維生素B12與牛血清白蛋白的相互作用時也得出了相似的結論。

2.4 紫外光譜分析

根據蛋白質的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基的紫外吸收峰不同，可以通過紫外光譜儀分析蛋白三級結構的變化[18]。由圖5可知，大豆分離蛋白在280 nm附近存在紫外吸收峰，而維生素B12在361、520、550 nm處存在紫外吸收峰，隨著維生素B12質量濃度的增大，大豆分離蛋白和維生素B12復合體系的紫外最大吸收峰由288 nm藍移到284 nm，說明維生素B12對大豆分離蛋白的結構產生了影響，色氨酸所處的微環境疏水性增強，這與熒光光譜分析中蛋白結構變化結果一致。并且大豆分離蛋白和維生素B12均為芳香族化合物，這種結構變化可能會促使其參與非共價的π-π堆積作用，文獻[31]也報道了大豆分離蛋白構象的變化與分子中色氨酸殘基和酪氨酸殘基芳香雜環的π-π*躍遷有關。

圖5 大豆分離蛋白與維生素B12復合體系的紫外光譜圖Fig.5 UV spectra of soybean protein isolate and vitamin B12 composite system

2.5 紅外光譜分析

紅外光譜是一種分析蛋白質二級結構的光譜技術[32]。通過紅外光譜可以進一步考察蛋白質構象的變化。加入不同質量濃度維生素B12的大豆分離蛋白紅外光譜如圖6所示。酰胺Ⅰ帶紅外吸收峰的變化主要反映了蛋白質二級結構的變化。根據已有的研究表明：蛋白質二級結構與各子峰間的對應關系為：波數1 646～1 664 cm-1處對應的結構為α-螺旋；波數1 615～1 637 cm-1和1 682～1 700 cm-1處對應的結構為β-折疊；波數1 664～1 681 cm-1處對應的結構為β-轉角；波數1 637～1 645 cm-1處對應的結構為無規則卷曲[33]。由圖6可知，維生素B12加入后，大豆分離蛋白的酰胺I帶發生輕微紅移(由1 633.3 cm-1紅移到1 635.8 cm-1)而酰胺Ⅱ帶基本沒有移動，可能是因為維生素B12與大豆蛋白發生了相互作用，通過氫鍵結合形成復合物，導致大豆分離蛋白肽鏈重排，最終導致二級結構的變化[34]。此外，大豆蛋白酰胺Ⅰ帶的強度有所減弱，說明α-螺旋的含量在加入維生素B12后明顯增加。文獻[31]研究大豆分離蛋白與花青素的相互作用發現，蛋白的酰胺I帶發生了紅移引起二級結構發生改變。

圖6 不同維生素B12質量濃度下大豆分離蛋白-維生素B12復合物中大豆分離蛋白的紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectra of SPI in soybean protein isolate and vitamin B12 complex

2.6 圓二色譜分析

圓二色譜是一種通過檢測水溶性蛋白進而計算各種蛋白質二級結構含量的技術。加入維生素B12前后，大豆蛋白的二級結構含量如表3所示。隨著維生素B12質量濃度的增大，大豆蛋白二級結構含量均發生了明顯的變化。α-螺旋和β-轉角相對含量逐漸升高，β-折疊和無規則卷曲相對含量逐漸降低，這表明β-折疊和無規則卷曲結構逐漸向α-螺旋和β-轉角結構轉變，可能是由于維生素B12與大豆蛋白表面的親水性側鏈結合，改變了蛋白的構象，一定程度上提高了蛋白質聚合程度[35]。圓二色譜的結果證明了維生素B12的結合改變了大豆蛋白的構象，改變了熒光基團周圍的局部微環境，形成了更有組織的構象，與紅外光譜得出的結果相一致。

表3 大豆分離蛋白-維生素B12復合物中大豆分離蛋白二級結構相對含量Tab.3 Relative content of SPI secondary structure in soybean protein isolate and vitamin B12 complex

3 結論

(1)熒光光譜分析表明，維生素B12對大豆分離蛋白具有熒光猝滅作用，猝滅機制為靜態猝滅，二者主要通過范德華力和氫鍵作用結合，結合位點數為1。

(2)同步熒光光譜分析表明，維生素B12與大豆分離蛋白的結合位點更接近色氨酸殘基；紫外吸收

光譜分析表明，維生素B12使得大豆蛋白中色氨酸殘基所處微環境發生變化，疏水性增強，改變了大豆蛋白的構象。

(3)紅外光譜和圓二光譜分析表明，維生素B12的加入改變了大豆分離蛋白的二級結構，具體表現為β-折疊和無規則卷曲相對含量減少、α-螺旋和β-轉角相對含量增加。