咖啡酸修飾單層石墨烯平面電極對煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的選擇性檢測

崔一鳴 何丹宇 李 開 路麗琴 羅紅霞

(中國人民大學(xué)化學(xué)系， 北京 100872)

1 引 言

石墨烯因其獨特的單原子厚度二維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、高導(dǎo)電性、大比表面積、卓越的電化學(xué)性能，近年來引起了廣泛的關(guān)注[1]。與其它材料相比，石墨烯具有高檢測面積、低背景電流、在大部分電解質(zhì)溶液中表現(xiàn)為化學(xué)惰性、良好的生物化學(xué)性質(zhì)、高遷移率等特點，廣泛應(yīng)用于電化學(xué)傳感領(lǐng)域[2]。然而，基于石墨烯的電極材料多由還原氧化石墨烯制得[3]。化學(xué)氣相沉積(Chemical vapor deposition，CVD)法在諸多應(yīng)用中，特別是制備大面積、單層和高質(zhì)量石墨烯膜方面展現(xiàn)出巨大的潛能。CVD石墨烯表現(xiàn)出電化學(xué)窗口寬[4]、電子轉(zhuǎn)移速率快、電化學(xué)催化能力強等特點[5]。單層CVD石墨烯已應(yīng)用于電化學(xué)傳感器中，因其具備的優(yōu)良特性，使得相應(yīng)傳感器的靈敏度、檢出限和選擇性等方面性能都得到改善[6]。

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)在多種脫氫酶中作為輔酶，并且在生物體的細(xì)胞新陳代謝的過程中起著至關(guān)重要的作用，因此對NADH的檢測引起了廣泛關(guān)注。在細(xì)胞呼吸鏈中，NADH在氧化態(tài)(NAD+)和還原態(tài)(NADH)之間轉(zhuǎn)換，并且在細(xì)胞呼吸、光合作用等過程中起著氫離子和電子載體的作用[7]。NADH在傳統(tǒng)電極表面的直接電化學(xué)氧化需要很大的過電勢[8]。過渡金屬納米顆粒[9,10]、金屬絡(luò)合物[11]、染料[12]、醌類化合物[13]及聚合物[11,14,15]等已成功地用作NADH氧化的媒介體。作為一種極有發(fā)展前景的材料，石墨烯已被廣泛應(yīng)用于電化學(xué)氧化NADH的研究中。在這些研究中，石墨烯常被用作媒介體的載體[16,17]。

谷胱甘肽(Glutathione，GSH)作為抗氧化劑，可與活性氧組分(如H2O2)及其它活性過氧化物反應(yīng)，能幫助人體保持正常的免疫系統(tǒng)功能，并具有抗氧化作用和整合解毒作用。研究表明，氧化后GSH的再生需要NADH，NADH的補充有助于GSH恢復(fù)到其活性形式[18,19]。因此，GSH水平與人體細(xì)胞內(nèi)NADH濃度有關(guān)。而葉酸(Folic acid，F(xiàn)A)是一種水溶性B族維生素，在細(xì)胞快速分裂和生長過程中具有重要的生物學(xué)意義[20]。女性在懷孕期間如果缺乏FA會導(dǎo)致多種病癥，如嬰兒脊柱、頭骨甚至大腦的發(fā)育畸形。高同型半胱氨酸水平與許多健康問題有關(guān)。FA有助于維持低同型半胱氨酸水平。在此過程中，同型半胱氨酸被代謝為半胱氨酸，并可轉(zhuǎn)化為GSH。將有害的同型半胱氨酸分解為有益的GSH，F(xiàn)A在此轉(zhuǎn)化過程中起到了促進(jìn)作用[21]。綜上，開發(fā)一種可同時檢測生物樣本(如尿液或血樣)中NADH、GSH和FA的方法具有重要意義。

有關(guān)同時檢測NADH、GSH和FA的報道多基于電化學(xué)方法[21]。高效液相色譜法(High performance liquid chromatography，HPLC)[22]也可用于NADH的測定。然而HPLC需要嚴(yán)格控制溫度，同時, HPLC設(shè)備的價格也遠(yuǎn)高于電化學(xué)工作站。HPLC法也需要保護(hù)和準(zhǔn)備檢測系統(tǒng)，有些HPLC技術(shù)還需要柱前衍生和熒光檢測過程[23]。

本研究組曾采用CVD少層石墨烯的邊緣制備了納米級厚度石墨烯納米線電極[24]，再將銅納米顆粒沉積在石墨烯納米線電極表面，構(gòu)建了一種無酶葡萄糖感器[25]。另外，本研究組將CVD少層石墨烯轉(zhuǎn)移到聚對苯二甲酸乙二醇酯(Polyethylene terephthalate，PET)薄膜上，制備石墨烯平面電極(Graphene platform electrode，GPE)。在此基礎(chǔ)上，將鐵氰化鈷修飾在GPE上，制備了H2O2傳感器[26]。將納米金顆粒修飾在GPE上， 制備了多巴胺(Dopamine，DA)傳感器[27]; 將聚L-半胱氨酸修飾在GPE上，實現(xiàn)了DA和抗壞血酸(Ascorbic acid，AA)的同時檢測[28]; 將金鉑雙納米顆粒與L-半胱氨酸修飾在GPE上，應(yīng)用于腎上腺素(Epinephrine，EP)的選擇性檢測[29]。在上述工作的基礎(chǔ)上，本研究利用單層CVD石墨烯制備了GPE，并將咖啡酸(Caffeic acid，CFA)修飾在GPE表面，從而實現(xiàn)在GSH和FA共存的條件下檢測NADH。據(jù)報道，許多酚類物質(zhì)和抗氧化劑因能降低NADH氧化的過電勢，并得到性能良好的修飾電極而被用于制備電化學(xué)傳感器[30～32]。在本研究中，利用電化學(xué)沉積固定在石墨烯表面的CFA能夠通過分子內(nèi)的鄰苯二酚結(jié)構(gòu)單元促進(jìn)NADH和石墨烯之間的電子轉(zhuǎn)移，使NADH氧化的過電位明顯降低。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

CHI660D 型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)，采用三電極系統(tǒng)：工作電極為 GPE 或 CFA-GPE，參比電極為 Ag/AgCl 電極，對電極為鉑絲電極; PB-10 pH計(德國 Sartorius公司); 7401F掃描電子顯微鏡(SEM)和能譜儀(EDS)一體機(jī)(日本JEOL公司); Lab Ram HR Evolution拉曼(Raman)光譜儀 (日本HORIBA公司); Prestige 21傅立葉變換紅外(FT-IR)光譜儀(日本 Shimadzu公司); Axis Ultra X-射線光電子能譜(XPS)儀(日本Kratos Analytical公司)。銅基底少層 CVD 石墨烯(深圳六碳科技有限公司); 聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA, Aladdin公司); 咖啡酸、NADH-Na2、谷胱甘肽、葉酸(Sigma-Aldrich 公司)。支持電解質(zhì)為0.1 mol/L的KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(PBS)。所用試劑均為分析純，實驗用水為 Milli-Q超純水(Millipore 公司純水儀制備)。人體尿樣來自于中國人民大學(xué)校醫(yī)院。

2.2 實驗方法

2.2.1 石墨烯電極的制備采用高分子支撐法，將生長在銅基底上的大面積高質(zhì)量的單層石墨烯薄膜轉(zhuǎn)移到PET上[33,34]。具體步驟如下：將1% (m/m)的PMMA苯甲醚溶液涂在銅基底CVD單層石墨烯上，120℃加熱5 min。由于在制備銅基底石墨烯的過程中，石墨烯會生長在銅基底的兩面，所以需要將另外一面生長的石墨烯擦掉。 隨后將PMMA/石墨烯/Cu浸泡在1 mol/L FeCl3和0.1 mol/L HCl混合溶液中20 min，通過FeCl3的作用將銅基底刻蝕掉; 用超純水清洗PMMA/石墨烯多次，并轉(zhuǎn)移到PET基底上，室溫條件下干燥。之后將得到的PMMA/石墨烯/PET浸泡在丙酮溶液中1 d，以除去附著在石墨烯表面的PMMA，隨后在60℃的條件下烘烤4 h, 即得到以PET為基底的石墨烯薄膜。用絕緣膠帶將石墨烯包裹，在一端露出0.3 cm × 0.3 cm的有效部分，另外一端的石墨烯用導(dǎo)電銅膠帶包裹，作為與電極之間的鏈接，得到GPE。上述完整制備流程如圖1所示。

2.2.2 CFA-GPE制備在石墨烯電極上修飾咖啡酸的方法與文獻(xiàn)[35]報道類似。在修飾CFA之前，GPE需要在0.1 mol/L NaHCO3溶液中, 在-1.1～1.6 V之間循環(huán)掃描，以進(jìn)行電化學(xué)活化，直至得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安(CV)圖。以活化的GPE為工作電極，在含有1 mmol/L CFA的0.1 mol/L PBS(pH 4.0)中，以50 mV/s的掃速在-0.1～0.9 V范圍內(nèi)連續(xù)掃描15圈，將咖啡酸修飾到GPE上，即可得到CFA-GPE。將CFA-GPE在超純水中清洗干凈，并在空氣中干燥， 備用。

圖1 (A) 制備單層石墨烯平面電極的流程; (B)所用的三電極體系的示意圖Fig.1 (A) Procedure for constructing monolayer graphene platform electrode (GPE); (B) Structural illustration of electrolytic cell used in this studyWorking electrode (WE): GPE; Counter electrode (CE): Pt wire; Reference electrode (RE): Ag/AgCl (3 mol/L KCl); CVD, Chemical vapor deposition; PMMA, polymethyl methacrylate

3 結(jié)果與討論

3.1 CFA-GPE的表征

由圖2A和2B中的掃描電鏡(SEM)圖可見，石墨烯在轉(zhuǎn)移到PET上(得到GPE)之后，延續(xù)了其在銅基底上的平整性和連續(xù)性，說明石墨烯被成功轉(zhuǎn)移到了PET基底上。對比圖2B和圖2C可見，聚CFA分子較均勻地覆蓋在平整的GPE表面。經(jīng)過電沉積，得到了CFA-GPE，伴隨著石墨烯粗糙程度的增加，聚CFA能夠很容易地被觀察到。通過AFM圖測量得到石墨烯的厚度約1.059 nm(圖2D)，說明本研究所使用的石墨烯是單層的[36]。在石墨烯的拉曼光譜圖上可以觀察到2676 cm-1處的2D峰和1563 cm-1處的G峰，兩個峰的強度之比I2D/IG≈2(圖2E，黑色線)。此結(jié)果表明所使用的石墨烯為單層的[37]。另外，1327 cm-1處出現(xiàn)的小D峰表明石墨烯上缺陷較少[37]，表明所用的石墨烯質(zhì)量很好。在CFA-GPE活化之后，D峰的強度增加，同時在1620 cm-1處出現(xiàn)了一個新的D峰(圖2E，紅色線)，而原始的石墨烯上未見此峰，這歸因于在NaHCO3活化的過程中，石墨烯蜂窩狀晶格的斷裂和石墨烯面的邊緣缺陷的形成[38]。同時, D和G峰的強度比(ID/IG)反映了O和C的含量比,ID/IG的增大表明在新的邊緣平面缺陷上附著了一些含氧基團(tuán)。

圖2 (A)銅片上的石墨烯、(B) GPE和(C) CFA-GPE的SEM圖; (D) 石墨烯在Si/SiO2基底上的AFM圖; (E)石墨烯在Si/SiO2基底上的拉曼光譜圖; (F) CFA-GPE的EDS譜圖; (G) CFA-GPE的C 1s XPS譜圖; (H) CFA-GPE的紅外光譜Fig.2 (A-C) Scanning electron microscopy (SEM) images of graphene on Cu, PET and caffeic acid (CFA)-GPE; (D) Atomic force microscopy (AFM) image of graphene transferred on Si/SiO2; (E) Raman spectra of graphene on Si/SiO2; (F) Energy dispersive spectrum (EDS) of CFA-GPE; (G) X-ray photoelectron spectrum (XPS) pattern of C 1s of CFA-GPE; (H) Fourier transform-infrared (FT-IR) analysis of CFA-GPE

3.2 不同沉積圈數(shù)對CFA-GPE性能的影響

為了優(yōu)化CFA在GPE上的沉積效果，考察了不同沉積圈數(shù)得到的CFA-GPE在含有0.1 mol/L NADH的PBS(pH=7.0)中的CV響應(yīng)(圖3A)。由圖3B可見，在沉積圈數(shù)為5～15時，所得到的CFA-GPE在NADH溶液中掃描得到的峰電流隨圈數(shù)的增加而增大。但沉積20圈時，峰電流反而下降。這可能是由于得到的CFA層過厚，過量的CFA覆蓋了GPE，導(dǎo)致電極表面的電荷傳輸效率變低。而當(dāng)沉積圈數(shù)過少時，催化位點及電極面積未達(dá)到最大。因此，選用15圈作為咖啡酸的沉積圈數(shù)。

圖3 (A)不同沉積圈數(shù)得到的CFA-GPE在含有1 mmol/L NADH的PBS(pH=7.0)溶液中的循環(huán)伏安圖; (B)不同沉積圈數(shù)得到的循環(huán)伏安圖的峰電流密度與圈數(shù)的柱狀統(tǒng)計圖Fig.3 (A) Cyclic voltammograms (CVs) of CFA-GPE obtain after different deposition cycles in PBS (pH 7.0) containing 1 mmol/L NADH at scan rate of 50 mV/s; (B) Peak current density in PBS containing 1 mmol/L NADH vs cycle number of deposition

3.3 CFA-GPE電化學(xué)行為的研究

以[Fe(CN)6]3-/4-體系作為探針評價CFA-GPE的電化學(xué)性能。首先比較了初始GPE、活化后的GPE和CFA-GPE在含有0.1 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-的0.1 mol/L KCl溶液中的CV響應(yīng)(圖4A)。由不同電極體系得到的峰電流密度大小次序為：活化的GPE>初始GPE>CFA-GPE。3種電極體系在1 mol/L [Fe(CN)6]3-/4-中的電化學(xué)阻抗譜見圖4B。 CFA-GPE的電子傳遞阻抗(Ret)比初始GPE和活化的GPE大得多，進(jìn)一步表明CFA已成功固定在GPE上; 而活化的GPE的Ret低于初始GPE，可能是由于在活化過程中有很多活性基團(tuán)吸附在了石墨烯上。電化學(xué)阻抗結(jié)果與CV結(jié)果一致。活化的GPE、初始GPE及CFA-GPE的Ret值分別約為232、578和2810 kΩ。

圖4 (A) 不同電極在含有0.1 mmol/L [Fe(CN)6]3-的0.1 mol/L KCl溶液中的循環(huán)伏安圖; (B) 未活化GPE (▲), 活化的GPE (●) 和 CFA-GPE (■)在含有1 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-的0.1 mol/L KCl溶液中的電化學(xué)阻抗譜圖，頻率范圍為0.01～100 HzFig.4 (A) CVs of different electrodes in 0.1 mol/L KCl containing 0.1 mmol/L [Fe(CN)6]3- between -0.1 V and 0.6 V with scan rate of 50 mV/s; (B) Nyquist plot of pristine GPE (▲), activated GPE (●) and CFA-GPE (■) in 0.1 mol/L KCl containing 1 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4- from 0.01-100 Hz

圖5A為不同掃速下CFA-GPE在PBS(pH=7.0)中的CV圖。隨著掃速增加，氧化峰電流密度(jpa)和還原峰電流密度(jpc)均線性增大(圖5B)，分別符合方程：jpa(μA/cm2)=0.00173v(mV/s) + 0.2860(R=0.9980)以及jpc(μA/cm2)=-0.00274(mV/s)-0.3067(R=0.9987)。因此， 此電化學(xué)過程是表面控制的過程,這也說明了CFA成功地沉積到GPE表面。另外，標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位(E0′)約為0.2 V， 且與掃速無關(guān)，表明電極在此過程中十分穩(wěn)定。

圖5 (A) CFA-GPE在0.1 mol/L PBS (pH=7.0)中不同掃速下的CV圖; (B)在不同掃速下氧化峰和還原峰的峰電流密度與掃速的關(guān)系曲線; (C) CFA-GPE在pH分別為2.01、 3.0、 4.0 5.0、 6.0 7.0、 8.0和8.98的0.1 mol/L PBS中的CV曲線; (D) 標(biāo)準(zhǔn)電位和pH的關(guān)系曲線Fig.5 (A) CVs of CFA-GPE in 0.1 mol/L PBS (pH 7.0) at various scan rates; (B) Plot of anodic and cathodic peak current density (jpa and jpc) vs. scan rate; (C) CVs of CFA-GPE in 0.1 mol/L PBS at pH values of 2.01, 3.0, 4.0 5.0, 6.0 7.0, 8.0 and 8.98, scan rate is 50 mV/s; (D) Corresponding plot of the E0′ vs pH values

考察了pH 2.01～8.98范圍內(nèi)pH值對CFA-GPE的影響(圖5C)。隨著pH值增大，CFA-GPE的氧化峰和還原峰均負(fù)移,這可能是由于CFA修飾膜在電極表面氧化為相應(yīng)的醌膜的過程中有質(zhì)子參與[16]。標(biāo)準(zhǔn)電位E0′和pH值呈線性關(guān)系(圖5D)，線性方程為E0′=-0.0512 pH + 0.569 (R=0.9975)。 此線性方程在pH 2.01～8.98范圍內(nèi)的斜率為51.2 mV/pH, 接近理論值59 mV/pH，說明CFA的氧化還原反應(yīng)是質(zhì)子與電子轉(zhuǎn)移數(shù)相等的過程，與文獻(xiàn)[33]報道一致。從圖5C可見，當(dāng)pH值增大時，CFA-GPE的電化學(xué)性能會變得越來越差，考慮到生物樣品的原始pH值，后續(xù)實驗選擇在pH=7.0的PBS中進(jìn)行。

3.4 NADH在CFA-GPE上的電化學(xué)響應(yīng)

圖6 (A) 未活化和活化的GPE在1 mmol/L NADH的PBS (pH=7.0)的溶液中的循環(huán)伏安圖，掃速為50 mV/s; (B) CFA-GPE在PBS以及含有1 mmol/L NADH的PBS溶液中的循環(huán)伏安圖; (C)在不同掃速下CFA-GPE在1mmol/L NADH PBS中的循環(huán)伏安圖; (D)掃速和氧化峰電流的線性關(guān)系曲線Fig.6 (A) CVs of the pristine GPE and the activated GPE in PBS (pH 7.0) containing 1 mmol/L NADH at scan rate of 50 mV/s; (B) CVs of CFA-GPE in PBS in the absence or presence of 1 mmol/L NADH at scan rate of 50 mV/s; (C) CVs of PBS containing 1 mmol/L NADH at the CFA-GPE with different scan rates; (D) Plot of jpa vs square root of scan rate

采用CV法研究了NADH在CFA-GPE上的電化學(xué)響應(yīng)。如圖6A所示，0.1 mmol/L NADH(pH=7.0 PBS中)在初始GPE和活化后的GPE上未出現(xiàn)任何響應(yīng)信號，說明裸GPE對NADH沒有電催化活性。當(dāng)工作電極為CFA-GPE時，在0.29和0.19 V出現(xiàn)一對氧化和再還原峰(圖6B，紅色線)。與空白PBS中的CV曲線(圖6B，黑色線)相比，氧化峰和還原電流均明顯增大。同樣條件下, NADH在玻碳電極上的氧化峰出現(xiàn)在0.72 V[8]，即CAF-GPE使NADH的過電位減小了0.43 V。在NADH存在下CFA-GPE的氧化峰電流增大，可能是由于溶液中的NADH擴(kuò)散到CFA-GPE表面，并將電化學(xué)氧化的CFA(CFAox)還原為原始還原態(tài)形式(CFAred)，同時NADH被氧化成其氧化態(tài)NAD+(圖7)，由于消耗了 CFAox，使得CFA的氧化反應(yīng)(反應(yīng)1)加速向右進(jìn)行。另一方面，CFA的還原峰在NADH存在時也增大，與相關(guān)報道不一致[21]，這可能是由于圖7中反應(yīng)(1)和反應(yīng)(2)都是可逆反應(yīng)，NADH同樣可以加速CFA的還原反應(yīng)。另外，單層石墨烯的獨特結(jié)構(gòu)在反應(yīng)中也起到了重要作用。采用NAD+代替NADH進(jìn)行實驗，得到了同樣結(jié)果，證實了以上推測的機(jī)理。綜上， CFA-GPE對NADH的氧化具有很好的電催化活性。

圖7 CFA作用下的NADH氧化還原機(jī)理Fig.7 Mechanisms of CFA-facilitated NADH oxidation

圖6C為不同掃速下NADH在CFA-GPE上的CV曲線。在掃速20～500 mV/s范圍內(nèi)，NADH的氧化峰電流與掃速的平方根成正比(圖6D)，線性方程為jpa(μA/cm2)=0.0425v1/2[(mV/s)1/2]-0.1069 (R= 0.9994)，表明NADH在此傳感器上的電化學(xué)氧化過程受溶液中NADH擴(kuò)散所控制。

3.5 CFA-GPE對NADH、 GSH和FA的同時檢測

圖8 (A)1.2 mmol/L NADH, 0.6 mmol/L GSH 和 0.8 mmol/L FA在GPE(紅)和CFA/GPE(黑)上DPV的對比，脈沖幅度為0.05 V，脈沖寬度為0.05 s; (B) NADH (0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0和1.2 mmol/L), GSH (0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5和0.6 mmol/L) 和 FA (0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7和0.8 mmol/L) 在不同濃度時候在CFA-GPE上的DPV曲線，0.1 mol/L PBS (pH=7.0); (C～E) 從圖(B)中得到的NADH、GSH、FA濃度和峰電流密度的線性關(guān)系Fig.8 (A)Differential pulse voltammetry (DPV) curves of 1.2 mmol/L NADH, 0.6 mmol/L GSH and 0.8 mmol/L FA on activated GPE (red) and CFA-GPE (black) with the pulse amplitude of 0.05 V, and the pulse width of 0.05 s; (B) DPV curves of different concentrations of NADH (0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 mmol/L), GSH (0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6 mmol/L) and FA (0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 mmol/L) at CFA-GPE in 0.1 mol/L PBS (pH 7.0); (C-E) Calibration plots of peak current density vs. concentration of NADH, GSH and FA, respectively. The pulse amplitude is 0.05 V, and the pulse width is 0.05 s

利用DPV法研究了NADH、GSH和FA在0.1 mol/L PBS(pH=7.0)溶液中的響應(yīng)。由圖8A可見，在活化的GPE上，3種組分的氧化峰均不明顯，而在CFA-GPE上，3種組分的氧化峰明顯增大且互不干擾測定。當(dāng)NADH的濃度在0.2～1.2 mmol/L、GSH的濃度在0.1～0.6 mmol/L、FA的濃度在0.3～0.8 mmol/L范圍內(nèi)變化時，各自峰電流均隨濃度的增加而增大(圖8B)，且峰電流與濃度均呈線性關(guān)系(圖8C～8E)。綜上，NADH、GSH和FA在CFA-GPE上的電催化氧化是互相獨立的，因此CFA-GPE可以實現(xiàn)對這3種物質(zhì)的分別檢測或同時檢測。

3.6 NADH的線性范圍和檢出限

圖9A為恒電位0.3 V時，NADH在CFA-GPE的計時電流曲線。在持續(xù)攪拌的條件下，每50 s向PBS(pH=7.0)溶液中加入NADH，得到的響應(yīng)電流與NADH濃度在0.001～1200 μmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系(圖9B)，線性方程為Ip(μA)=0.0032CNADH(μmol/L) + 0.0173 (R2=0.9991)，檢出限為0.52 nmol/L (S/N=3)。與其它文獻(xiàn)報道的方法相比(表1)，CFA-GPE具有線性范圍寬、檢出限低、過電勢小等優(yōu)點。

圖9 (A) 0.3 V恒電位下，CFA-GPE對NADH的計時電流曲線(0.1 mol/L PBS，pH=7.0)，加入NADH的范圍為0.001～1200 μmol/L, 插圖為此曲線在0～550 s范圍內(nèi)的放大圖; (B)NADH氧化電流與濃度的線性關(guān)系Fig.9 (A) Amperometric responses of the CFA-GPE after subsequent addition of NADH in a 0.1 mol/L PBS (pH=7.0) solution at working potential of 0.3 V. Inset is the enlarged view of amperometric response within 0-550 s; (B) Calibration plots of peak current vs. concentration of NADH

表1 不同的NADH檢測方法的主要性能對比

Table 1 Comparison of performance of reported modified electrodes for electrochemical detection of NADH

3.7 CFA-GPE穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和抗干擾能力

使用同一根CFA-GPE對0.1 mmol/L NADH檢測50次，得到峰電流的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.6%。 制備10根CFA-GPE對0.1 mmol/L NADH進(jìn)行檢測，RSD為3.1%。將一支CFA-GPE在室溫存放，兩周后測得的峰電流是初始電流的95%，45天后為92%。上述結(jié)果表明， CFA/GPE具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，可用于NADH的實際檢測。

為了探究CFA-GPE檢測NADH的抗干擾能力，在0.1 mol/L PBS (pH=7.0)中加入0.1 mmol/L NADH，同時加入1000倍的NaCl、KCl、CaCl2、MgSO4、葡萄糖(Glc)， 500倍的抗壞血酸(AA)、多巴胺(DA)、尿酸(UA); 850倍的谷氨酸(Glu)、纈氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)及甘氨酸(Gly), 采用計時電流法觀測干擾物在CFA-GPE表面的電化學(xué)響應(yīng)。由圖10A可見，在加入不同干擾物后，電流響應(yīng)幾乎不變，而當(dāng)再次加入0.1 mmol/L NADH時，電極再次產(chǎn)生明顯的變化。同時探究了酚類物質(zhì)對CFA-GPE的影響。如圖10B所示，在加入酚類物質(zhì)后，電極沒有明顯的響應(yīng)。上述結(jié)果說明，CFA-GPE傳感器對于檢測NADH具有良好的選擇性。

圖10 (A) 恒電位0.3 V下，CFA-GPE對0.1mmol/L NADH; 100 mmol/L的NaCl、KCl、CaCl2、MgSO4、Glc; 50 mmol/L的AA、DA、UA和85 mmol/L的Glu、Val、Phe、Gly的安培響應(yīng); (B) CFA-GPE對0.1 mmol/L NADH、飽和的鄰硝基苯酚、對溴苯酚、對氯間二甲苯酚(PCMX)、對硝基苯酚和間氨基苯酚的安培響應(yīng)Fig.10 (A) Amperometric response of CFA-GPE upon the addition of 0.1 mmol/L NADH and 100 mmol/L NaCl, KCl, CaCl2, MgSO4, Glc, 50 mmol/L AA, DA, UA and 85 mmol/L Glu, Val, Phe, Gly at working potential of 0.3 V; (B) Amperometric response of CFA-GPE upon the addition of 0.1 mmol/L NADH and saturated nitrosophenol, p-bromophenol, p-chloro-m-xylenol (PCMX), p-nitrophenol, m-aminophenol

3.8 實際樣品分析

選擇人體尿液樣品進(jìn)行分析，用0.1 mol/L PBS(pH=7.0)將尿樣稀釋10倍，對7份樣品進(jìn)行DPV測定，結(jié)果見表2，回收率在99.8%～104.0%之間，說明此傳感器可用于NADH的實際樣品檢測。

表2 人體尿液樣本中NADH的檢測結(jié)果

Table 2 Detection results of NADH in human urine sample analysis

樣品Sample加入濃度Added(μmol/L)測得濃度Found(μmol/L)回收率Recovery(%)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%, n=3)155.2104.01.122020.2101.22.83100100.0100.01.54200201.9100.91.55300300.1100.12.26400399.199.81.47500500.3100.11.1

4 結(jié) 論

將CVD單層石墨烯電極(GPE)通過在NaHCO3溶液連續(xù)CV掃描進(jìn)行活化，然后通過電化學(xué)沉積的方法將CFA修飾在GPE表面。CFA修飾的GPE表現(xiàn)出一對良好的氧化還原峰，并對NADH的氧化具有顯著的電催化作用。此傳感器可用于在GSH、FA存在下檢測NADH或?qū)?種組分進(jìn)行同時檢測，具有線性范圍寬、檢出限低、抗干擾能力強等特點。本傳感器探究了單層石墨烯在電化學(xué)傳感方面的應(yīng)用，操作簡單，成本低廉，有望廣泛應(yīng)用于電化學(xué)傳感器領(lǐng)域。