基于聚苯胺納米孔的DNA分析

趙 怡 石曉雨 孫 紅 姚付軍 亢曉峰

(西北大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 合成與天然功能分子化學(xué)教育部重點實驗室， 西安 710069)

1 引 言

作為一種簡單、快速、免標(biāo)記的生物傳感技術(shù)[1]，納米孔單分子分析在分析化學(xué)[2]、生物物理[3,4]、環(huán)境化學(xué)[5]等領(lǐng)域受到越來越廣泛的關(guān)注。納米孔單分子分析的原理是基于納米孔阻塞電流變化的幅度和頻率，實現(xiàn)對分析對象的分子尺寸、分析物濃度等物理化學(xué)性質(zhì)的定性和定量分析[6]。目前，生物和固態(tài)納米孔已被廣泛應(yīng)用于單分子化學(xué)反應(yīng)、單分子檢測以及單分子DNA測序等領(lǐng)域，涉及的研究對象包括金屬離子[7,8]、有機(jī)小分子[9]、多肽[10]、酶[11]、蛋白質(zhì)[11]、DNA[12]、RNA[13]等。目前，納米孔DNA分析面臨兩個主要挑戰(zhàn): (1) DNA的穿孔速率過快; (2) DNA的穿孔幾率較低，限制了納米孔核酸檢測的靈敏度和選擇性。為解決這一問題，研究者發(fā)展了多種策略，以提高納米孔對DNA的捕獲率或延緩DNA的穿孔速率，包括電壓控制、溫度控制、鹽梯度、pH值調(diào)控、采用高粘度緩沖溶液等[14～16]。本研究組以往的研究表明，采用四甲基氯化銨(TMACl)替代傳統(tǒng)的KCl溶液，能夠有效降低DNA的穿孔速率，并增加納米孔對DNA的捕獲效率[17]。但這些策略多集中于對實驗條件的改變，而且會對生物孔所依賴的磷脂雙分子層膜的穩(wěn)定性帶來較大的影響。因此，發(fā)展一種可進(jìn)行化學(xué)修飾的固體納米孔分析技術(shù)，并將其應(yīng)用于對DNA的分析檢測是非常必要的。

聚苯胺(PANI)是目前研究最廣泛的一種導(dǎo)電聚合物。由于具有較好的電化學(xué)活性、化學(xué)穩(wěn)定性及生物相容性等特點，PANI成為一種適宜的基底材料制備化學(xué)、生物傳感器和納米器件[18,19]。近年來，基于PANI納米結(jié)構(gòu)和復(fù)合材料構(gòu)建的生物傳感器在小分子、DNA和微生物分析檢測中展現(xiàn)出良好的信號放大效應(yīng)和抗干擾特性[20～22]。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Axopatch 200B膜片鉗放大器和1440A A/D數(shù)字轉(zhuǎn)換器(美國Axon Instruments公司); 4040A函數(shù)發(fā)生器(美國BK Precision公司); 6487型皮安計(美國Keithlay公司)。

苯胺(分析純, ≥99.5%，成都科龍化工試劑廠); (NH4)2S2O8(分析純, ≥99%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司); 單離子徑跡聚碳酸酯膜(PC膜，德國GSI研究所); DNA(上海生物工程股份有限公司); HCl(分析純，36%～38%， 四川西隴科學(xué)有限公司); NaCl(分析純≥99.5%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司); KCl(分析純, ≥99.0%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司); LiCl(分析純, ≥99.5%，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心); 三羥甲基氨基甲烷(分析純, ≥99.5%，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司); NaOH(分析純, ≥99.5%， 重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司); 實驗用水為超純水(18.25 MΩ·cm)。DNA序列見表1。

2.2 實驗方法

2.2.1 PC膜的刻蝕[24]分別用95%乙醇、水洗滌單離子徑跡PC膜。將PC膜固定在電解池中間，用紫外燈在254 nm波長下照射膜的兩面各2 h，向電解池兩端均加入5 mol/L NaOH刻蝕液。Ag/AgCl作為工作電極，插在PC膜兩側(cè)的電極槽中。施加1 V恒定電壓，以實時表征單孔的通道電流隨刻蝕時間的變化。達(dá)到所需電流值時停止刻蝕，并用1 mol/L HCl和超純水清洗膜，得到單孔PC膜。

表1 本研究所用的DNA序列

Table 1 DNA sequences used in this study

DNA序列Name堿基序列Sequence單鏈DNASingle-stranded DNA (ssDNA)5'-TGC ACG GTC GAT CAA GTA C-3'雙鏈DNADouble-stranded DNA (dsDNA)5'-TGC ACG GTC GAT CAA GTA C-3'3'-ACG TGC CAG CTA GTT CAT G-5'

2.2.2 聚苯胺修飾單孔PC膜移取275 μL苯胺單體(An)溶于10 mL 1 mol/L HCl溶液中，攪拌均勻后得An-HCl溶液; 向反應(yīng)池兩端各加入2 mL An-HCl溶液，浸泡12 h; 稱取0.2282 g (NH4)2S2O8(APS)溶于10 mL 1 mol/L HCl中，攪拌均勻，得到APS-HCl溶液; 吸出反應(yīng)池一端的An-HCl溶液，并用水洗滌數(shù)次后，加入APS-HCl溶液。反應(yīng)4 h后，依次用乙醇、水清洗，于室溫下干燥24 h。

2.2.3 聚苯胺納米孔的電化學(xué)性能檢測將單孔PC膜、修飾有聚苯胺的單孔PC膜分別固定在電解池中，Ag/AgCl為工作電極，電解池兩端均加入2 mL電解質(zhì)溶液，用皮安計以掃場方式輸出-1～1 V電壓，得通道I-V曲線。

2.2.4 DNA的預(yù)處理ssDNA、dsDNA粉末樣品分別以3000～4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心1 min; 向DNA樣品離心管中均加入滅菌水，配制濃度為100 μmol/L DNA母液; 高速渦旋2～3 min使DNA溶液混勻; DNA樣品加熱到95℃，自然冷卻至室溫; dsDNA需將互補(bǔ)鏈混勻; 將所得樣品于4 ℃保存。

2.2.5 聚苯胺納米孔DNA分析向電解池兩端均加入緩沖液(cis端接地，另一端為trans端)，在cis端加入適量DNA，用膜片鉗放大器采集穿孔信號，儀器采樣頻率為100 kHz，濾波頻率為3 kHz。使用pClamp10.3和Origin 8.5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計和分析，平均滯留時間直方圖(τoff)滿足單指數(shù)分布，平均阻塞電流直方圖(ΔI)滿足高斯分布。

3 結(jié)果與討論

3.1 聚苯胺納米孔的制備及電化學(xué)表征

圖1 (A)聚苯胺(PANI)納米孔檢測DNA穿孔過程的示意圖，灰色部分為基底-單離子徑跡聚碳酸酯膜(PC膜)，綠色表示PANI涂層; (B)PANI的化學(xué)結(jié)構(gòu); (C)PC納米孔刻蝕過程的電流-時間變化，插圖為刻蝕電流為0～0.5 nA時的電流-時間曲線; (D)PC納米孔修飾PANI前后，通道I-V曲線的對比，插圖為放大后的PANI納米孔的通道I-V曲線。實驗條件: 1 mol/L KCl， 10 mmol/L Tris-HCl，pH= 7.0Fig.1 (A) Schematic of DNA analysis by polyaniline (PANI) nanopore, Single-ion track polycarbonate membrane (PC membrane) is shown as gray section, PANI is shown as green section; (B) Chemical structure of PANI; (C) The current-time changing for the PC nanopore etching process, the inset is current-time curve between 0 and 0.5 nA; (D) Comparison of single-channel I-V curves between bare nanopore and PANI nanopore, the inset shows I-V curve of PANI nanopore. Experimental condition: 1 mol/L KCl, 10 mmol/L Tris-HCl, pH=7.0

3.2 PANI納米孔對ssDNA的穿孔行為的研究

采用未修飾且具有相似孔徑大小的PC膜納米孔開展了ssDNA穿孔實驗，研究表明，在0.1 mol/L KCl溶液中， +900 mV 電壓作用下， 未檢測到ssDNA的穿孔信號(圖2A)。這可能是由于ssDNA穿孔速率太快，超出了單通道儀器檢測的分辨率。然而，將ssDNA加入到聚苯胺納米孔的檢測池中，可以看到明顯的電流阻塞信號。修飾聚苯胺后的納米孔基線波動較大，這可能是由于孔內(nèi)壁聚苯胺涂層不均勻引起。對照實驗結(jié)果表明，在ssDNA不存在時，或施加-900 mV電壓，無電流阻塞信號產(chǎn)生，證明此信號確實是由ssDNA與聚苯胺納米孔相互作用產(chǎn)生。圖2B為ssDNA穿孔滯留時間柱狀圖，通過單指數(shù)擬合發(fā)現(xiàn)，其值為τoff=(1.14 ± 0.05) ms，因此ssDNA的平均穿孔速率約為48.2 μs/base。同其它納米孔相比(DNA穿孔速率約1～20 μs/base)[17,25～28]，DNA在聚苯胺納米孔的穿孔速率減小2.4～48倍。這是由于帶正電荷的聚苯胺與帶負(fù)電荷的DNA存在著靜電相互作用，延緩了DNA的穿孔時間。圖2C為ssDNA阻塞電流的柱狀圖，符合高斯分布，其統(tǒng)計值ΔI= (7.01 ± 0.14) pA。為了驗證聚苯胺對ssDNA存在著靜電相互作用，進(jìn)行了聚苯胺納米孔對ssDNA的靜態(tài)吸附實驗。向緩沖液加入ssDNA(終濃度0.5 μmol/L)，經(jīng)10 h靜態(tài)吸附后，對PANI納米孔進(jìn)行電化學(xué)I-V表征。如圖2D所示，相比于未進(jìn)行吸附實驗的聚苯胺納米孔，吸附DNA后的聚苯胺納米孔在正電壓下的電流值變小，而在負(fù)電壓下電流值變大，并且吸附DNA后，PANI納米孔幾乎不具有整流效應(yīng)。這是由于PANI納米孔對DNA的靜電吸附作用使得內(nèi)部的電荷分布發(fā)生了變化，孔壁中原本帶正電荷的PANI被吸附的DNA覆蓋后，表面的電荷發(fā)生中和，導(dǎo)致孔壁的凈電荷密度減小，因此納米通道無明顯的整流效應(yīng)。通過研究不同電壓下ssDNA的穿孔行為發(fā)現(xiàn)，穿孔時間隨著電壓的增加而逐漸減少，據(jù)此可推斷ssDNA穿過了聚苯胺納米孔(圖2E)。電壓依賴性實驗發(fā)現(xiàn)，ssDNA的穿孔頻率隨電壓的增加而接近線性增大，表明擴(kuò)散控制的捕獲過程起主導(dǎo)作用(圖2F)。進(jìn)一步的研究表明，在0.1 mol/L KCl溶液中，當(dāng)施加電壓V<700 mV， 幾乎檢測不到DNA的穿孔信號，這可能是因為ssDNA受到的電場力不足以克服聚苯胺對其的靜電吸引力，難以使DNA從管壁內(nèi)部脫附下來，并穿過納米通道。另外一個可能的因素是由于低電壓產(chǎn)生的電滲流較小，未能驅(qū)動ssDNA進(jìn)入聚苯胺納米孔，因而也未產(chǎn)生阻塞電流。

圖2 ssDNA在PANI納米孔中的穿孔分析: (A)PANI修飾前后的PC納米孔對ssDNA分析的trace及特征穿孔信號; (B、C) ssDNA穿孔信號的滯留時間柱狀圖和振幅柱狀圖; (D)加入DNA前后，PANI納米孔通道I-V曲線的變化(使用的電解液為1 mol/L KCl, 10 mmol/L Tris-HCl, pH=7); (E)在PANI納米孔中，ssDNA的平均滯留時間隨電壓的變化; (F)聚苯胺納米孔對ssDNA的捕獲率隨電壓的變化。實驗條件: 0.1 mol/L KCl, 10 mmol/L Tris-HCl, pH=7.0； 電壓: + 900 mVFig.2 Translocation behavior of ssDNA in PANI nanopore： (A) Current trace and characteristic translocation signal of ssDNA in the nanopore before and after PANI modification (voltage: +900 mV); (B， C) Histograms of dwell time (τoff) and amplitude for ssDNA (0.1 mol/L KCl, 10 mmol/L Tris-HCl, pH=7.0; voltage: +900 mV); (D) I-V curves of PANI nanopore before and after the DNA adsorption experiments (1 mol/L KCl, 10 mmol/L Tris-HCl, pH=7.0); (E) Relationship between mean dwell time of ssDNA with voltage; (F) Capture rate of ssDNA vs voltage

在納米孔DNA分析中，多采用KCl或NaCl作為電解質(zhì)溶液，但其穿孔速率過快或穿孔幾率過低的缺點影響了納米孔單分子分析的靈敏度和分辨率。Kowalczyk等[25]研究發(fā)現(xiàn)，采用Li+作為ssDNA的抗衡離子，能夠有效減小其所帶電荷，增加其穿孔時間，分辨率至少提高10倍。最近，Hu等[29]研究表明，Li+可減少蛋白納米孔對長鏈ssDNA的捕獲能壘，使其穿孔幾率增強(qiáng)了10.23倍。

在0.1 mol/L LiCl溶液中，向檢測池cis端加入50 nmol/L ssDNA并施加+900 mV的電壓后，單通道電流trace及特征阻塞信號如圖3A所示。研究表明，相比于0.1 mol/L KCl溶液(τoff=(1.14 ± 0.05) ms)，ssDNA在0.1 mol/L LiCl溶液中阻塞電流信號的平均滯留時間統(tǒng)計值(τoff=(1.55 ± 0.14) ms)是其的1.36倍(圖3B)。當(dāng)Li+濃度增加到1 mol/L和3 mol/L時，ssDNA穿孔時間分別增加了2.35倍和8.91倍，其統(tǒng)計值分別為(3.64 ± 0.16) ms和(13.82 ± 0.76) ms。這是因為相比于K+，Li+與ssDNA具有更強(qiáng)的鍵合作用[27]，能有效降低ssDNA鏈上所帶的負(fù)電荷，因此,在相同電壓下，ssDNA在Li+溶液中受到較小的電泳力作用，導(dǎo)致其穿孔速率減慢。而且隨著Li+濃度增加，ssDNA的表面會結(jié)合更多的電荷抗衡離子，導(dǎo)致受到的電場驅(qū)動力更小，因而穿孔時間更長。雖然DNA表面負(fù)電荷的減少使其受到聚苯胺靜電作用減小，導(dǎo)致穿孔速率增加，但電場力的主導(dǎo)作用使得ssDNA的滯留時間延長。研究還發(fā)現(xiàn)，高濃度Li+能產(chǎn)生更大的ssDNA電流阻塞幅度。ssDNA在不同濃度LiCl中穿孔頻率如圖3D所示，在0.1 mol/L LiCl(+900 mV)中，ssDNA的穿孔頻率為(83.25 ±2.69) s-1，是同濃度KCl溶液中的1.30倍((64.07± 0.05) s-1)。在納米孔單分子分析中，電滲流(EOF)的大小影響分析物的穿孔頻率，當(dāng)EOF和EP的方向相同時，EOF越大，穿孔頻率越大。而EOF的強(qiáng)度依賴于施加在納米孔兩端的電壓、電解質(zhì)的濃度、電解質(zhì)的類型等因素。以往的研究表明，EOF在LiCl中的強(qiáng)度比在KCl中大[27,30]。因此，在本研究中，施加相同電壓(+900 mV)時，ssDNA在0.1 mol/L LiCl中穿孔幾率比在同濃度KCl中大。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，隨著Li+濃度增加，ssDNA的穿孔頻率降低，這與文獻(xiàn)[30]一致[30]。這可能是由于隨著鹽濃度增加，聚苯胺納米孔內(nèi)壁的正電荷受到的屏蔽效應(yīng)增大，導(dǎo)致孔的離子選擇性降低，進(jìn)而使EOF降低。總之，采用LiCl作為電解質(zhì)溶液可明顯增加聚苯胺納米孔對ssDNA的捕獲率，同時增加ssDNA的穿孔時間。

圖3 (A,B) ssDNA在不同濃度LiCl鹽中穿孔行為、特征阻塞信號及滯留時間柱狀圖; (C)在0.1 mol/L KCl以及不同濃度的LiCl中，ssDNA穿孔信號的平均滯留時間對比; (D)不同濃度的LiCl中，PANI納米孔對ssDNA捕獲率的比較。檢測電壓: +900 mVFig.3 (A,B) Typical current trace, characteristic event and dwell time histogram of ssDNA in different concentrations of LiCl; (C) Comparison of mean dwell time of ssDNA in 0.1 mol/L KCl and LiCl; (D) The capture rate of PANI nanopore in various concentrations of LiCl. Detection voltage: +900 mV

3.3 PANI納米孔對dsDNA穿孔行為的研究

為了進(jìn)一步拓展聚苯胺納米孔的應(yīng)用范圍，考察了dsDNA在0.1 mol/L LiCl中的穿孔行為。向檢測池中加入50 nmol/L dsDNA后，在電場力的作用下(+900 mV)，產(chǎn)生了類似ssDNA的阻塞電流信號(圖4A)。圖4B和4C是dsDNA滯留時間柱狀圖和振幅柱狀圖，分別經(jīng)單指數(shù)擬合和高斯擬合后，獲得的統(tǒng)計值為τoff=(1.25 ± 0.11) ms、ΔI=(13.34 ± 0.17) pA。隨著電壓的增加，dsDNA的穿孔時間逐漸減小，可推斷dsDNA也能穿過聚苯胺納米孔(圖4D); 且dsDNA的平均滯留時間比ssDNA短(圖4E)， 這是因為dsDNA所帶負(fù)電荷比ssDNA多，受到較強(qiáng)的電場力; 同時，dsDNA的剛性螺旋結(jié)構(gòu)減弱了其與聚苯胺的親和力，因而能以更快的速率穿過納米孔。比較二者振幅大小發(fā)現(xiàn)(圖4F)，dsDNA穿過聚苯胺納米孔產(chǎn)生的阻塞電流幅度大于ssDNA，這是因為dsDNA的直徑大于ssDNA的直徑，因此，由dsDNA“體積排阻效應(yīng)”造成的振幅比ssDNA大。由于ssDNA和dsDNA能很好的區(qū)分， 因而可以采用聚苯胺納米孔構(gòu)建生物傳感器，通過設(shè)計合適的DNA探針，實現(xiàn)與病理相關(guān)的目標(biāo)DNA的靈敏且快速的檢測。

圖4 PANI納米孔對dsDNA分析: (A)dsDNA 穿孔trace圖和特征信號; (B)dsDNA的滯留時間柱狀圖; (C)dsDNA的振幅柱狀圖; (D)dsDNA 平均滯留時間隨電壓的變化; (E、F) dsDNA和ssDNA穿孔信號的比較。實驗條件為: 0.1 mol/L LiCl (10 mmol/L Tris-HCl, pH=7), 檢測電壓: +900 mVFig.4 Analysis of dsDNA by PANI nanopore: (A) Current trace and characteristics signal of dsDNA; (B) Dwell time histogram of dsDNA; (C) Amplitude histogram of dsDNA; (D) Relationship between mean dwell time of dsDNA with voltage; (E， F) Comparison of dsDNA and ssDNA. Experimental conditions: 0.1 mol/L LiCl buffered with 10 mmol/L Tris-HCl, pH=7. The applied voltage was +900 mV

4 結(jié) 論

采用化學(xué)合成法將聚苯胺修飾在固態(tài)納米通道的內(nèi)壁，研究了ssDNA和dsDNA的穿孔行為究。結(jié)果表明，聚苯胺涂層對DNA的靜電相互作用是納米孔對DNA分析具有較高分辨率的主要原因。對電解質(zhì)類型和濃度的影響的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，LiCl能夠延緩DNA的滯留時間，并提高聚苯胺納米孔的捕獲率。本研究提供了一種控制DNA穿孔行為的方法，具有操作簡單、價格低廉的優(yōu)勢。