銅離子介導的石墨烯量子點熒光開-關高選擇性檢測谷胱甘肽

李欣玉 張 強 王 妮 劉加軍 王 健*

(發光與實時分析系統重慶市市級重點實驗室1，國家級藥學實驗教學示范中心2， 西南大學藥學院， 重慶 400715)

1 引 言

作為一種含有活性巰基的短肽，谷胱甘肽(GSH)參與了體內的多種生化反應，如可防止體內某些含巰基蛋白質的氧化，保障體內代謝的正常進行[1]; GSH的巰基可與體內的自由基結合，防止自由基對體內器官的損傷[2]。另外，癌細胞中的GSH含量明顯高于正常細胞，且GSH的耗竭與腫瘤細胞凋亡有密切關系，因此，監測細胞中GSH的含量有利于監控人體健康狀況[3]。近年來已開發出多種檢測GSH的方法，包括熒光法[4]、散射法[5]、比色法[6]、電化學[7]、高效液相色譜[8]等，但有些方法易受半胱氨酸等巰基化合物的干擾[9]，因此，有必要開發高靈敏、選擇性的方法，實現GSH的選擇識別[10]。

石墨烯量子點(GQDs)的尺寸通常小于10 nm，因制備簡單且具有良好的生物相容性、優異的光學性質和較強的成像能力，被認為是熒光染料和半導體量子點的理想替代品[11,12]，被廣泛用于生物傳感[13，14]及細胞成像[15，16]。目前。大部分檢測策略基于GQDs與靶物直接作用，但方法的選擇性差、抗干擾能力不強，因此，需要開發新的策略，以提高方法的選擇性。其中，熒光信號開-關策略是一種有效手段[17]，該方法能夠提高信號單向變化檢測模式的選擇性。在典型的開-關策略中，通常需要中間介質誘導探針信號的降低或升高，介質結合目標物，誘導信號恢復。

本研究利用微波法合成了GQDs，并基于聚集誘導熒光猝滅[18]機理實現了GSH的選擇性識別(圖1)。GQDs表面富含氨基，可與Cu2+配位而拉近GQDs之間的距離，導致GQDs聚集，進而發生熒光猝滅。在GQDs-Cu2+中加入GSH后，由于GSH與Cu2+之間有更強的結合能力，導致Cu2+從GQDs表面解離，致使GQDs解聚集，從而使熒光恢復。本方法以Cu2+為開關，控制了GQDs熒光信號的猝滅與恢復，據此建立了GSH的檢測方法，提高了方法的選擇性，并用于細胞裂解液中GSH的檢測。

圖1 Cu2+介導的石墨烯量子點熒光開-關檢測GSH示意圖Fig.1 Illustration of Cu2+-mediated fluorescence switching of graphene quantum dots(GQDs) for highly selective detection of glutathione(GSH)

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

F-2500熒光分光光度計(日本日立公司); UV-3600紫外-可見分光光度計、FTIR-8400S傅里葉紅外光譜儀、XRD-7000 X射線衍射儀(日本島津公司); Tecnai G2 F20 S-TWIN高分辨透射電子顯微鏡(HRTEM，美國FEI公司)，加速電壓200 kV; ESCALAB 250 X-射線光電子能譜儀(XPS, 美國賽默飛世爾科技公司); FL-TCSPC熒光光譜儀(法國Horiba Jobin Yvon公司); C11347絕對量子產率儀器 (日本濱松公司); Synergy H1 多功能酶標儀(美國Berton公司); DL-1電子萬用爐(北京市永光明醫療儀器有限公司); P70D20P-NPCWO微波爐(格蘭氏公司); 離心機(上海安亭科學儀器廠); GDH 9070A鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司); 800Y多功能粉碎機(南陽東億機械設備有限公司)。

GSH、半胱氨酸、組氨酸、谷氨酸、賴氨酸等生物分子(Sigma公司); CuSO4(阿拉丁試劑有限公司); HCl、NaOH、NaCl等其它無機試劑(成都科龍化學試劑有限公司)。實驗用水為超純水(18.2 MΩ·cm， Mili-Q公司純水儀制備)。銀杏葉采自西南大學校園。

2.2 實驗方法

2.2.1 石墨烯量子點的合成先將銀杏葉用自來水沖洗干凈，接著用蒸餾水沖洗3遍，放入500 mL燒杯中瀝干水分，在鼓風干燥箱中60℃烘干，然后用多功能粉碎機制成粉末。稱取上述銀杏葉粉末約0.6 g，加入40 mL超純水中并充分攪拌，加熱煮沸，保持微沸10 min，之后用0.22 μm濾膜過濾，將濾液繼續用微波爐中火加熱15 min，使溶液完全蒸干。取出后，加20 mL水，超聲處理200 s， 10000 r/min離心10 min，再次用0.22 μm濾膜過濾。邊攪拌邊逐滴加入0.1 mol/L HCl，調節混合液至中性，最后用透析袋(1000 MWCO)透析48 h，將所得GQDs冷凍干燥，于4℃保存，備用。

2.2.2 細胞毒性實驗考察在96孔板中的每孔中加入100 μL A549細胞(1×105cell/mL)，在細胞培養箱中孵育(37℃，5% CO2)24 h后，用PBS緩沖液清洗兩次，再分別加入10 μL不同濃度的GQDs (0、10-4、10-3、10-2、0.1、1和10 μg/mL)和90 μL RPMI 1640培養基(添加2%胎牛血清)，繼續孵育24 h。用PBS緩沖液清洗2次后，再加入10 μL CKK-8溶液和90 μL RPMI 1640培養基(添加2%胎牛血清)，繼續孵育40 min，用酶標儀測定450 nm處的吸光度值，按公式(1)計算細胞存活率(Cell viability, CV)，評價GPDs對細胞的毒性:

(1)

其中，ODtreated為實驗組的吸光度，ODcontrol為對照組的吸光度。

2.2.3 GSH的檢測在1.5 mL試管中依次加入50 μL BR緩沖溶液(pH 6.8)、 50 μL GQDs (10 mg/mL)、 50 μL Cu2+(2.5 mmol/L)和不同濃度的GSH溶液，混勻后加水稀釋至0.5 mL，在室溫下靜置20 min，測定GQDs的熒光強度。

2.2.4 細胞裂解液中GSH的測定細胞裂解液的制備[19]如下: A549細胞在RPMI 1640培養基(添加2%胎牛血清)中孵育(37℃，5% CO2) 24 h，用胰酶消化，并用PBS緩沖液洗滌2次，然后重復冷凍和解凍，確保細胞完全裂解。為除去細胞碎片和蛋白質，以14000 r/min離心10 min，并用0.22 μm微孔膜過濾，收集濾液，于4℃儲存，備用。將20 μL細胞裂解液與50 μL BR緩沖溶液(pH 6.8)、 50 μL GQDs (10 mg/mL)、 50 μL Cu2+(2.5 mmol/L)以及50 μL不同濃度的GSH溶液(500、1000和2000 μmol/L)混勻后，加水稀釋至0.5 mL，在室溫下靜置20 min，測定GQDs的熒光強度。

3 結果與討論

3.1 石墨烯量子點的特征

3.1.1 石墨烯量子點的形貌結構表征利用透射電鏡(TEM)及原子力顯微鏡(AFM)觀察了GQDs的形貌結構(圖2)。TEM照片表明，GQDs呈單顆粒均勻分散，平均粒徑為2.4 nm，其面內晶格間距為0.33 nm(圖2A)，對應于石墨碳的(002)平面，說明合成的碳納米材料具有類石墨結構[20]。X光衍射(XRD)譜在27.3°有一個寬峰，根據布拉格方程計算出對應0.33 nm處的晶格間距(圖2B)。AFM結果(圖2C和2D)表明，GQDs的高度約為1 nm，可推斷出GQDs由3層左右石墨烯層組成[21]。

圖2 GQDs的形貌表征: (A) GQDs的透射電鏡照片，內嵌圖為GQDs的晶格和粒徑分布圖; (B) GQDs的X射線衍射譜; (C)和(D)分別為GQDs的原子力顯微鏡照片和高度分布，其中D圖中a～c的高度對應于圖C中標記為a～c的GQDsFig.2 Morphological characterization of GQDs: (A) Transmission electron microscope (TEM) image of GQDs. Inset is lattice spacing and size distribution of GQDs; (B) X-ray diffraction (XRD) pattern of GQDs; (C) Atomic force microscope (AFM) image; (D) Height distribution of GQDs, and the heights of a-c in Fig.D corresponding to a-c of GQDs in Fig.C

圖3 GQDs的元素和官能團分析: (A) GQDs的X射線光電子能譜(XPS)全譜; (B)C1s譜; (C) N1s 譜; (D) O1s譜Fig.3 Eelemental and functional group analysis of GQDs: (A) X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) full spectrum of GQDs; (B) C1s spectrum; (C) N1s spectrum; (D) O1s spectrum

3.1.2 石墨烯量子點的光譜特征GQDs具有良好的吸收和發射性能。GQDs在紫外-可見區具有非常寬的紫外吸收帶，在278 nm處具有肩峰，可歸因于納米碳的π-π*躍遷[16]。熒光光譜表明，GQDs的最大激發波長為360 nm，最大發射波長為463 nm，在365 nm紫外光照射下呈現藍色(圖4A)，量子產率為1.4%，且隨著激發光譜的改變，GQDs的發射光譜波長并未發生改變(圖4B)，說明此GQDs的粒徑或者表面狀態比較均一[22]。

圖4 (A) GQDs (2.5 μg/mL)的吸收、激發和發射光譜，內插圖為石墨烯量子點在白光及365 nm紫外燈照射下的照片; (B)不同激發波長(300～400 nm)對應的發射光譜Fig.4 (A) Absorption, excitation and emission spectra of GQDs (2.5 μg/mL), inset shows photographs of GQDs irradiated by white light and 365 nm UV lamp; (B)Emission spectra of GQDs at different excitation wavelengths in the range of 300-400 nm

3.1.3 石墨烯量子點的穩定性研究一般的碳納米材料具有良好的穩定性[12]。研究表明，不同的陰陽離子(除Cu2+外)未引起GQDs熒光強度的明顯變化，說明GQDs具有優越的抗離子干擾能力(圖5A和5B)。在較高濃度的NaCl溶液中，GQDs的熒光強度幾乎沒有降低，說明GQDs具有很好的抗鹽能力(圖5C)。同時，研究了GQDs的抗光漂白能力，發現GQDs在紫外光照射2 h后仍保持較高的發光強度(圖5D)，說明GQDs具有較強的光穩定性。但是GQDs熒光發射依賴于環境的酸度，在酸性條件下，其熒光強度較低; 中性和堿性條件下，其熒光強度較為穩定(圖5E)。綜上，此GQDs比較穩定，有利于GQDs在復雜樣品中的進一步應用。

圖5 濃度均為2 mmol/L的 (A)陰離和(B)陽離子對GQDs熒光強度的影響; (C)不同濃度的NaCl對GQDs熒光強度的影響; (D) 365 nm紫外燈的連續照射對GQDs熒光強度的影響; (E)不同酸度條件對GQDs熒光的影響。 GQDs濃度均為2.5 μg/mL; F0為GQDs的熒光信號，F為加入其它物質后GQDs的熒光信號Fig.5 Fluorescence response of GQDs to (A) various anions and (B) various cations at 2 mmol/L respectively;; (C) The fluorescence response of GQDs to different concentrations of NaCl; (D) Fluorescence response of GQDs fluorescence under 365 nm UV light irradiation; (E) Fluorescence response of GQDs under different acidities. Conditions: cGQDs: 2.5 μg/mL; F0 is the fluorescence intensity of GQDs; F is the fluorescence intensity of GQDs in the presence of the species

3.1.4 石墨烯量子點的生物相容性研究結果表明，碳納米材料具有較好的生物相容性[12]。為了評價GQDs的生物相容性，使用CKK-8法測定A549細胞存活率。 如圖6所示， 當GQDs濃度為1 μg/mL時， 細胞存活率大于90%，說明GQDs對細胞的毒性較小。

圖6 不同濃度GQDs處理后的A549細胞存活率Fig.6 Cell viability of A549 cells treated with different concentrations of GQDs

3.2 基于石墨烯量子點的熒光法檢測GSH

3.2.1 條件優化考察了酸度、反應時間及Cu2+濃度等因素對檢測靈敏度的影響。GQDs-Cu2+混合液與GSH反應20 min后，GQDs的熒光強度趨于穩定，說明已反應完全(圖7A)。因GQDs的熒光強度依賴于環境的酸度，故GQDs-Cu2+與GSH的反應也依賴于環境酸度(圖7B)。結果表明，中性條件下，Cu2+能較大程度地猝滅GQDs的熒光，且GSH與Cu2+結合后能夠引起熒光信號的恢復，而酸性和堿性條件都不利于GQDs與Cu2+之間的配位。一方面，在酸性條件下，GQDs的氨基發生質子化，不利于與Cu2+配位[23]; 另一方面，在堿性條件下，Cu2+容易水解，不利于與GQDs進行配位反應。酸性和堿性條件都不利于熒光的猝滅，加入GSH后，熒光恢復程度也不大。故選擇pH 6.8的BR緩沖溶液控制溶液的酸度。

采用熒光恢復效率(F2/F1)篩選Cu2+的最佳濃度，使其在“關”態和“開”態之間達到最佳效果。當Cu2+的濃度過低時，會導致“關閉”效率低下，加入GSH后，GQDs的熒光信號恢復程度較低; 當Cu2+濃度過高時，溶液中有大量游離的Cu2+直接與GSH結合，不能有效地恢復熒光，即“開啟”效率較低。當Cu2+濃度為250 μmol/L時，熒光恢復效率達到最佳(圖7C)。

圖7 反應條件的優化: (A)反應時間的影響，1 μg/mL GQDs， pH 6.8; 250 μmol/L Cu2+， 500 μmol/L GSH; (B)酸度的影響， 1 μg/mL GQDs，反應時間 20 min，250 μmol/L Cu2+， 500 μmol/L GSH ; (C) Cu2+濃度的影響， 1 μg/mL GQDs， pH 6.8，反應時間 20 min，500 μmol/L GSH。F1為加入Cu2+后GQDs熒光強度; F2為在GQDs-Cu2+混合液中加入GSH后的熒光強度Fig.7 Optimization of reaction conditions: (A) Effect of reaction time. 1 μg/mL GQDs, pH 6.8, 250 μmol/L Cu2+, 500 μmol/L GSH, (B) Effect of acidity, 1 μg/mL GQDs, reaction time is 20 min, 250 μmol/L Cu2+; 500 μmol/L GSH; (C) Effect of Cu2+concentration, 1 μg/mL GQDs, reaction time is 20 min, pH 6.8, 500 μmol/L GSH. F1 is the fluorescence intensity of GQDs in the presence of Cu2+; F2 is the fluorescence intensity of GQDs-Cu2+ mixture in the presence of GSH

3.2.2 基于GODs檢測GSH的方法的分析性能最佳實驗條件下，在GQDs-Cu2+混合液中加入GSH，GQDs的熒光強度逐漸恢復(圖8A)。 GSH濃度在 20～500 μmol/L范圍內與熒光信號的恢復程度(F2/F1)呈良好的線性關系(圖8B)，檢出限(LOD，3s/k)為3.4 μmol/L，與色度法[6]和電化學-試紙條法[7]相比，本方法較靈敏，且選擇性好(圖8C)，半胱氨酸(Cys)等物質不干擾GSH的檢測。這是因為作為一種嗜硫金屬離子，Cu2+對巰基化合物具有較強的結合力[24]; 且GSH的空間結構特殊， 具有巰基、氨基和羧基3個潛在的配位位點[25]，與Cu2+的結合常數最高[26]，因此本方法具有較好的選擇性。

圖8 方法的分析性能和選擇性: (A) GQDs隨GSH濃度變化的熒光光譜; (B)GQDs熒光恢復程度與GSH濃度的線性關系, 1 μg/mL GQDs， 250 μmol/L Cu2+，反應時間 20 min，pH 6.8; (C) GQDs檢測GSH的選擇性，1 μg/mL GQDs， 250 μmol/L Cu2+，反應時間 20 min，pH 6.8，氨基酸及GSH的濃度均為300 μmol/L. F1為加入Cu2+后GQDs熒光強度; F2為在GQDs-Cu2+混合液中加入GSH或氨基酸后的熒光強度Fig.8 Performance and selectivity of the proposed method: (A) Fluorescence spectra of GQDs in the presence of different concentrations of GSH; (B) Linear relationship between F2/F1 and the concentration of GSH, 1 μg/mL GQD, pH 6.8, reaction time is 20 min, 250 μmol/L Cu2+; (C) Selectivity of GQDs towards determination of GSH, 1 μg/mL GQDs, pH 6.8, reaction time is 20 min, 250 μmol/L Cu2+, the concentrations of amino acids and GSH are 300 μmol/L respectively. F1 is the fluorescence intensity of GQDs in the presence of Cu2+; F2 is the fluorescence intensity of GQDs-Cu2+ mixture in the presence of GSH or amino acids

3.2.3 細胞裂解液中GSH的檢測為了驗證GQDs-Cu2+混合物檢測GSH的可行性，測定了A549細胞裂解液中的GSH，并進行了加標回收實驗(表1)。GSH是哺乳動物細胞內最豐富的抗氧化劑，且在大多數細胞中，超過90%的細胞內硫醇分子是GSH[19]。本研究以A549細胞為模型細胞，采用2.2.4節的方法將細胞裂解液稀釋20倍， 測定GSH的平均含量為197.8 μmol/L，計算得A549細胞裂解液中原始GSH含量為3.96 mmol/L，與細胞中GSH的正常濃度(0.5～10 mmol/L)[27]相吻合，表明本方法可用于細胞裂解液中GSH的檢測。細胞裂解液中GSH的回收率為93.2%～101.5%，相對標準偏差(RSD)為4.4%～5.8%，表明所建立的GSH檢測方法具有良好的實用性。

表1 細胞裂解液中GSH的檢測結果

Table 1 Detection results of GSH in cell lysate (n=3)

樣品Sample測得量Found(μmol/L)加入量Spiked(μmol/L)總測得量Total found(μmol/L)回收率Recovery(%)RSD(%, n=3)1190.250.0236.893.25.82198.8100.0295.296.44.43204.5200.0407.5101.55.6

3.3 石墨烯量子點檢測GSH的機理

由于GSH是一種含有巰基的三肽，作為一種嗜硫金屬離子，Cu2+對GSH具有較強的結合力[24]; 而GSH具有特殊的空間結構，具有巰基、氨基和羧基3個潛在的配位位點[25]，與Cu2+的結合常數高[26]，形成更穩定的配合物，因此在GQDs-Cu2+復合物中加入GSH后，Cu2+從GQDs表面競爭下來，使GQDs聚集體發生解聚，從而導致GQDs熒光恢復。

圖9 反應機理的研究: (A) Cu2+存在時GQDs吸收光譜的變化; (B) Cu2+存在時GQDs的TEM照片; (C) Cu2+存在時GQDs的紅外光譜的變化; (D) Cu2+存在時GQDs的熒光壽命的變化Fig.9 Mechanism investigation: (A) Absorption spectral change of GQDs in the presence and absence of Cu2+; (B) TEM image of GQDs in the presence of Cu2+; (C) Infrared spectral change of GQDs; (D) Fluorescence lifetime change of GQDs

4 結 論

利用微波法合成了表面富含氨基的GQDs，以此GQDs為光學探針, 以Cu2+為開關，開發了GSH的高選擇性檢測方法。表面富含氨基的GQDs與Cu2+發生配位作用而發生聚集誘導熒光猝滅，由于GSH與Cu2+結合能力更強，使Cu2+從GQDs解離，導致GQDs解聚而發生熒光恢復。GSH和Cu2+的較強的配位作用及熒光“開-關”作用賦予本方法優異的選擇性，應用于細胞裂解液中GSH的檢測,結果令人滿意。 本方法可針對其它目標進一步推廣，有利于提高方法的選擇性。