神經遞質檢測方法的研究進展

萬金霞 李毓龍*,3,4

1(北京大學生命科學學院膜生物學國家重點實驗室， 北京100871) 2(北京大學麥戈文腦科學研究所， 北京100871)3(北大-清華生命科學聯合中心， 北京100871) 4(北京腦科學與類腦研究中心， 北京100871)

1 引 言

在人類的大腦中存在數以億計的神經元，后者通過數萬億的突觸組成復雜的神經網絡。不同種類的神經元通過近端或遠程投射控制著一系列重要的生理活動，包括運動、感知、意識、情緒、學習和記憶等[1]。神經元之間的交流主要依賴于化學突觸，突觸前神經元發放動作電位，位于突觸前膜上電壓依賴型的鈣離子通道打開，并引起鈣離子的內流，后者進一步導致突觸小泡與突觸前膜融合，并將小泡內的神經遞質釋放到突觸間隙，神經遞質與位于突觸后膜的受體結合，引起下游神經元興奮性的改變，最終實現神經元之間信號的轉導[2]。

神經遞質的正常釋放對于維持機體正常的生理功能發揮著重要作用，同時，神經遞質的釋放與調節出現異常時也與一系列的病理過程相關，如抑郁癥(Depression)、成癮(Addiction)、帕金森氏癥(Parkinson's disease，PD)和阿爾茲海默癥(Alzheimer's disease，AD)等[3～6]。因此，在分子、細胞、環路等層面精確地分析檢測神經遞質是如何參與并調節上述生理和病理過程，能夠更深入地了解疾病的發病機制，并為臨床藥物的開發奠定基礎。人類的大腦中存在上百種神經遞質，包括氨基酸類神經遞質(如谷氨酸 (Glu)、γ-氨基丁酸 (GABA))、單胺類神經遞質(如多巴胺 (DA)、去甲腎上腺素(NE)、五羥色胺 (5-HT))、膽堿類神經遞質(如乙酰膽堿(ACh))、多肽類神經遞質(如阿片肽、催產素)等。其中，大腦主要的興奮性神經遞質谷氨酸以及抑制性神經遞質γ-氨基丁酸在突觸前膜釋放后，可快速地與位于突觸后膜的離子型受體結合，并引起神經元興奮性的改變[7]。但對于多巴胺、催產素這類神經遞質而言，其受體主要是代謝型受體，即GPCR，這類受體介導的信號轉導相較于離子型受體時程更長、空間更廣[8]。不同種類的神經遞質釋放模式的復雜性、時間空間的差異、受體種類以及分布的不同，使得精確檢測神經遞質釋放的難度大大增加，傳統的電生理檢測方法很難實現此目標[9～11]。近年來，為了實現對神經遞質釋放的精確檢測，已開發了包括生物化學和電化學等一系列檢測方法。同時，隨著成像技術的高速發展，可遺傳編碼的熒光探針也逐步發展起來。本文對近年發展的可檢測神經遞質釋放的新方法進行了評述。

2 神經遞質的檢測方法

2.1 微透析法

微透析法(Microdialysis)是一種對待測組織損傷相對較小、靈敏度較高的方法，被廣泛用于檢測大腦中的各種生物分子，包括神經遞質、激素以及其它化學小分子的分布和動態變化過程。微透析系統含有一個微透析探頭，探頭前端被半透的中空纖維膜覆蓋，兩端與人工腦脊液(Artificial cerebrospinal fluid， ACSF)的入口管和出口管相連。使用該系統檢測大腦中神經遞質的動態變化，首先要將微透析探頭插入待研究的腦區，并對該系統灌流ACSF， 使其以0.5～2.0 μL/min的速度持續不斷地通過微透析探頭前端的半透膜，與大腦中的腦脊液進行物質交換，在此過程中，細胞外液中的神經遞質通過被動擴散作用穿過半透膜進入ACSF，之后回收透析液，利用高效液相色譜(High performance liquid chromatography， HPLC)或氣相色譜(Gas chromatography，GC)將不同的神經遞質分離出來，通過質譜(Mass spectroscopy， MS)分析腦脊液中每種神經遞質的含量，最終實現對神經遞質的檢測[12,13](圖1A)。由于此系統持續地對微透析探頭灌流ACSF，因此在樣品采集位置很難建立神經遞質的化學梯度平衡，導致透析液中的神經遞質濃度低于采樣位置的實際濃度。為了提高對采樣位置神經遞質濃度測量的準確度，可通過降低ACSF的灌流速度使其盡量建立平衡; 同時，為保證樣品中神經遞質的含量足夠在后續系統中被檢測出來，只能在一定程度上降低該系統的采樣頻率，導致該系統的時間分辨率較低。盡管微透析法可在復雜的神經系統中實現對各種神經遞質相對精確、靈敏、長時程的檢測，但由于其時間分辨率比較低，單次采樣時間通常約10 min，因此很難實時地檢測大腦中快速變化的神經遞質[14]。

2.2 電化學法

除了利用微透析的方法檢測神經遞質濃度的變化，基于氧化還原反應原理的電化學檢測方法近年也逐步發展起來。安培法(Amperometry)被用于檢測可被氧化還原的神經遞質的動態變化[15]。利用此方法檢測神經遞質釋放時， 需要將電極放置在被記錄細胞表面附近，給予電極一個固定的電壓，并保持該電壓高于被檢測神經遞質的氧化還原電位。當神經遞質從細胞釋放并擴散至電極表面，會被氧化，進而發生電子的轉移，通過電極記錄到的電流指示神經遞質的釋放[16]。最初，由于電極的直徑過大，很難檢測單個細胞的分泌反應，通過改進電極的尺寸、材料和記錄方法，使得該方法可檢測神經遞質從單個突觸小泡的釋放[17]。由于氧化還原反應非常迅速，該方法能夠以毫秒級別的時間分辨率檢測神經遞質的動態變化。然而，安培法是基于氧化還原的原理開發的，因此只能用于檢測易于被氧化還原的物質，而對于乙酰膽堿等難以被氧化還原的神經遞質則比較困難。此外，這種檢測方法缺乏特異性，不能區分不同的神經遞質，凡是可被特定電位氧化還原的物質均能產生電子，并被電極記錄，因此，這種方法通常與HPLC聯用，實現神經遞質的特異性檢測[18]。目前，此方法已被應用于檢測腎上腺嗜鉻細胞去甲腎上腺素的釋放、肥大細胞五羥色胺的釋放、活體大鼠伏隔核(Nucleus accumbens， NAc)內源多巴胺的釋放[19,20]等。

快速掃描循環伏安法(Fast scan cyclic voltammetry，FSCV)是基于氧化還原反應原理的方法，被廣泛用于檢測可被氧化還原的神經遞質的釋放[21]。FSCV與Amperometry的區別在于FSCV給予電極的是呈特定波形并不斷變化的電壓，而不是恒定的電壓，不同的神經遞質在不同的電壓下發生氧化還原反應，并產生相對應的電流，因此，該方法相比于安培法的優勢是可在一定程度上區分不同的神經遞質，已被廣泛用于小鼠腦片以及活體小鼠研究單胺類神經遞質的釋放。如Marcinkiewcz等[22]使用該方法在小鼠腦片上記錄到大腦中縫背核(Dorsal raphe nucleus，DRN)五羥色胺能神經元釋放的五羥色胺(圖1B); Saylor等[23]也成功地在活動小鼠的海馬(Hippocampus)中記錄到不同發情周期內五羥色胺的釋放。雖然FSCV具有較高的時間分辨率和一定的神經遞質分子的特異性，但難以實現對多個區域的同時檢測。此外，雖然碳纖電極的直徑可達到微米級別，但是依然難以精確定位到特定突觸，很難實現亞細胞特異性檢測。

圖1 (A)利用微透析方法檢測小鼠大腦中神經遞質釋放的原理示意圖; (B) 利用FSCV在小鼠腦片上檢測五羥色胺的釋放, 左圖是不同電壓下對應的五羥色胺氧化電流的偽彩圖，右圖是對應電流-電壓曲線圖[22]Fig.1 (A) Schematic diagram of detection of neurotransmitter release in mouse brain in vivo by microdialysis system; (B) Fast scan cyclic voltammetry detection of serotonin release in mouse brain slices with color plot (left) and cyclic voltammograms trace (right)[22]

2.3 熒光成像法

2.3.1 檢測下游報告基因的Tango-assay隨著熒光共聚焦顯微鏡(Confocal microscopy)、雙光子顯微鏡(Two-photon excitation microscopy)、受激發射損耗顯微鏡(Stimulated emission depletion microscopy)等新型顯微鏡技術的發展，光學成像方法在各個領域得到廣泛應用。 應用光學成像的方法解決生物學問題具有很多優勢，如將其與熒光蛋白聯合使用可觀察特定生物分子在細胞內的定位、基因的表達、蛋白和蛋白之間的相互作用等過程。在神經遞質的檢測方面，光學成像方法因其靈敏性高、對樣品損傷小、可實時觀測等特點而得到了極快的發展。

2008年，Barnea等[24]開發了一種通過兩種融合蛋白之間的相互作用啟動下游報告基因表達檢測神經遞質釋放的方法，并命名為Tango assay。這種檢測方法的原理是將一種細胞膜定位的受體(如GPCR)與一種轉錄因子(如tTA)融合在一起，并在這兩種蛋白之間插入一段可被特異性蛋白酶識別的酶切位點(如煙草花葉病毒TEV蛋白酶識別的酶切位點)，同時，將一種在膜受體激活后可與之發生相互作用的蛋白(如β-arrestin2)與相對應的蛋白酶相融合。當神經遞質激活GPCR后，β-arrestin2會被招募到GPCR附近，并與之發生相互作用，此時TEV蛋白酶會對GPCR與tTA之間的酶切位點進行識別與切割，繼而tTA被釋放，并進入細胞核，啟動下游報告基因熒光素酶的表達，最終通過熒光素酶催化的熒光反應實現對神經遞質的檢測(圖2A)。基于此方法開發的Tango-mapping 系統已被成功地用于檢測活體果蠅內源多巴胺的釋放及其參與的神經環路[25]。Tango assay具有兩方面的優勢: 一方面，基于神經遞質的內源受體開發，具有較高的分子特異性; 另一方面，通過轉錄因子啟動報告基因的表達對信號產生放大作用，使得該系統具有較高的靈敏性。由于技術層面的限制，該檢測系統背景信號較高，信噪比較低，且配體結合引起下游報告基因的表達是不可逆的，不能被特異的受體拮抗劑阻斷，這些因素都限制了該系統在活體動物中的應用。

2017年，Lee等[26]對Tango assay進行改造，并將新的系統命名為iTango(圖2B)。iTango是一個包含3組件開關的控制系統，該系統由兩種融合的蛋白質組件以及一個帶有四環素反應元件(Tetracycline response element，TRE)的單個報告基因載體組成。第一個組件是由一個膜神經遞質受體融合表達一系列其它的蛋白元件構成，包括一個截短的與隱花色素相互作用的元件(Cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix， CIBN)、一個截短的對藍光敏感的元件(Light-sensitive LOV2 domain of Avena Sativa phototropin 1， AsLOV2)和一個受四環素調控的轉錄因子tTA相融合，AsLOV2和tTA之間有一個TEV蛋白酶識別位點[27,28]。第二個組件是將β-arrestin2和TEV蛋白酶的N端部分融合; 最后一個組件是將介導光反應的植物隱花色素光裂合酶的同源區域(Photolyase homology region of the CRY2 protein from Arabidopsis thaliana，CRY2PHR)與TEV蛋白酶的C端部分融合。為了降低TEV蛋白酶自發的酶切活性，該系統用TEV識別位點代替與PAS 序列緊密結合的藍光敏感元件的Jα 螺旋的C端。在膜受體被相應配體激活的情況下，β-arrestin2被招募與膜受體結合發生相互作用，使得TEV蛋白酶的N端靠近受體; 同時給予藍光照射，CRY2PHR與CIBN也發生相互作用，使得TEV蛋白酶的C端部分也靠近受體，和N端部分相互靠近， 形成有功能的TEV蛋白酶并切割其識別位點，釋放tTA進入細胞核，與TRE結合，啟動下游報告基因的表達。隨后，該研究組對該系統進一步優化，將CRY2PHR-CIBN這對光開關去除，并將新系統命名為iTango2(圖2C)，該系統已被成功用來標記以及操縱小鼠大腦中接收多巴胺的神經元。相比于最初的Tango assay，iTango2具有背景信號低、信噪比高的優點，但由于轉錄因子啟動下游報告基因的表達需要數分鐘至數小時，時間分辨率相對較低，在瞬息萬變的神經網絡里，依然很難檢測到神經遞質的動態變化。

圖2 (A)Tango assay通過下游報告基因檢測配體與受體結合原理示意圖; 基于iTango assay(B)與iTango2 assay(C)原理構建的檢測多巴胺釋放的試驗體系示意圖Fig.2 (A) Schematic diagram of detecting binding between ligand and corresponding G protein coupled receptor by Tango assay through downstream reporter gene; Schematic diagram of detecting dopamine release by iTango assay (B) and iTango2 assays (C)

圖3 基于CNiFER原理構建的分別可以檢測(A)乙酰膽堿、(B)多巴胺以及(C)去甲腎上腺素的探針原理示意圖Fig.3 Schematic diagram of cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters strategy for detection of (A) acetylcholine, (B) dopamine and (C) norepinephrine

2.3.2 基于細胞系構建的神經遞質探針基于細胞系構建的神經遞質探針M1-CNiFERs(Cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters)是Nguyen等[29]于2010年為檢測內源乙酰膽堿的釋放而開發的。他們將一個代謝型的乙酰膽堿受體(M1)與基于熒光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer，FRET)原理構建的鈣離子探針TN-XXL表達在人胚胎腎細胞系HEK293T中，M1與乙酰膽堿結合會招募下游Gq蛋白，通過三磷酸肌醇(IP3)信號通路引起細胞中鈣離子濃度的升高，鈣離子探針檢測到鈣離子濃度的變化，并通過改變熒光信號的強度最終反應乙酰膽堿濃度的變化(圖3A)。由于此探針是基于內源乙酰膽堿受體與乙酰膽堿的結合引發下游信號通路的原理構建的，因此保留了受體與配體結合的特異性與親和力，而且通過下游信號通路的放大作用增強了探針的靈敏度。通過將表達M1-CNiFERs的細胞系種植在小鼠的大腦皮層，可檢測到電刺激基底核(Nucleus basalis of meynert，NBM)乙酰膽堿能神經元遠程投射到皮層釋放的乙酰膽堿。此外，他們還構建了多巴胺探針(D2-CNiFERs)和去甲腎上腺素探針(α1A-CNiFERs)的細胞系，并成功用于檢測活體小鼠內源神經遞質的釋放[30,31](圖3B和3C)。此方法具有一定的時間和空間分辨率、對神經遞質具有高度的特異性、靈敏度和親和力，但將外源細胞系植入動物大腦中存在一定的困難，包括細胞移植的操作要求較高、受體動物的免疫排斥反應等。

2.3.3 化學遺傳探針SnifitsSnifits探針通過一個熒光蛋白與一個發色基團或者兩個發色基團之間的能量共振轉移檢測神經遞質濃度的變化[32]。Snifits是基于SNAP-tag以及CLIP-tag標記的探針，其中SNAP-tag可特異地與活細胞中的芐基鳥嘌呤(Benzyl guanine，BG)衍生物形成共價鍵。 這類探針通常包含一個SNAP-tag、一個熒光蛋白或者CLIP-tag、一個可與神經遞質結合的蛋白(Binding protein，BP)、一個合成的可與BP結合的帶發色團的配體分子(圖4A和4B)。合成的配體通過相應的BG衍生物偶聯到SNAP-tag上，在分子內與BP結合。神經遞質不存在時，探針處于關閉的狀態; 神經遞質出現時，與合成的配體分子競爭，后者從BP上解離下來, 探針切換到開放的狀態，兩個發色團之間的位置發生改變，影響二者之間FRET的效率。此方法已被用于開發γ-氨基丁酸的探針，此探針以一個代謝型的GABAB受體作為BP，與SNAP-tag、CLIP-tag蛋白融合表達，同時，SNAP-tag和CLIP-tag分別連接一個發色團，作為FRET的供體和配體[33]。除此之外，此方法還被用于開發谷氨酸和乙酰膽堿的探針，但此類探針尚未用于活體動物中檢測內源神經遞質的釋放[34,35]。 此類探針具有較高的靈敏度和特異性，但需要將外源合成的發色團偶聯到SNAP-tag，導致較高的背景，限制了其在活體動物體內的應用。

圖4 (A)帶有熒光蛋白的Snifits類探針和(B)帶有CLIP-tag的Snifits類探針構建的原理示意圖Fig.4 Schematic diagram of Snifits sensors with a fluorescent protein (A) and with a CLIP-tag (B)

2.3.4 可遺傳編碼的熒光探針(1)基于細菌周質結合蛋白(Periplasmic binding protein，PBP)構建的可遺傳編碼的神經遞質熒光探針。目前，已開發的可遺傳編碼、具有較高時空分辨率、高分子特異性以及高靈敏度檢測神經遞質釋放的熒光探針主要分為兩類，一類以細菌PBP為骨架，另一類以GPCR為骨架。細菌PBP種類繁多，為構建神經遞質探針提供了良好的蛋白骨架。以檢測谷氨酸釋放的熒光探針為例，早期的谷氨酸探針FLIP-E以及改良版的SuperGluSnFR均是基于FRET原理構建的，融合了來自細菌中可與谷氨酸結合的蛋白ybeJ以及兩個可發生FRET的熒光蛋白，但此類探針在體使用的信噪比不高[36～38]。后期的谷氨酸探針iGluSnFR依然使用了ybeJ蛋白，但是沒有FRET原理，而是改用經過循環重排并對構象變化敏感的綠色熒光蛋白(Circular permutated enhanced green fluorescent protein, cpEGFP)[39](圖5A)。iGluSnFR相較于原來的SuperGluSnFR在信噪比方面有了較大的提升，更適合在體檢測內源谷氨酸的釋放，此外，單個熒光蛋白占用的光譜相較于原來兩個熒光蛋白占用的光譜更窄，因此可與其它顏色的探針聯合使用，更適用于多色成像系統[31,40]。此后，基于單個熒光蛋白以及細菌PBP骨架構建的可遺傳編碼的神經遞質探針被相繼開發出來，包括可檢測γ-氨基丁酸的iGABASnFR及可檢測ATP的iATPSnFR[41,42]。來自細菌的PBP雖可與神經遞質結合，作為探針的骨架蛋白，但并不適用于大規模神經遞質探針的開發。一方面，并非所有的神經遞質都能找到可與之結合的PBP，尤其是神經肽類; 另一方面，PBP蛋白來自于細菌，將其表達在真核細胞中，容易出現膜定位差、表達量低等問題。(2)基于G蛋白偶聯受體(GPCR)構建的可遺傳編碼的神經遞質熒光探針。GPCR是一大類膜蛋白受體的統稱，這類受體具有相對保守的七次跨膜結構，其配體包括氣味分子、神經遞質、激素、趨化因子等，在真核細胞中發揮重要的信號轉導作用[43]。已知的大部分神經遞質都有相應的GPCR作為受體，因此，GPCR作為一類可與神經遞質結合的天然內源性受體是構建可遺傳編碼神經遞質探針的首選骨架。其優勢主要有兩方面: 一方面， GPCR來自于真核細胞，不存在由原核轉移到真核細胞引起的蛋白表達及包裝運輸方面的問題; 另一方面，GPCR作為神經遞質本身的內源受體，保留了二者之間的高選擇性和親和力。基于已解析的GPCR晶體結構，結構生物學家發現配體與GPCR結合后，主要引起后者的第五和第六個跨膜區構象的改變，并且此變化在不同的GPCR中較為保守[44～47]。因此，通過將cpEGFP插入到連接第五和第六個跨膜區的第三個胞內環(Intracellular Loop 3，ICL3)的位置，配體與GPCR的結合會引起后者構象的改變，而這種變化又引起cpEGFP發生構象的變化，進一步影響其發色團周圍的微環境，最終導致其熒光強度的改變。基于GPCR激活原理構建的神經遞質探針被命名為GRAB(GPCR Activation Based Sensor)探針(圖5B)，如GRABACh、 GRABDA、 GRABNE[48～50]。

圖5 (A)基于PBP蛋白構建的可以檢測谷氨酸釋放的熒光探針原理示意圖; (B)基于GPCR激活原理構建的GRAB系列探針的原理示意圖Fig.5 (A) Schematic diagram of glutamate sensor based on PBP; (B) Schematic diagram of GPCR Activation Based Sensor, GRAB

以GRABDA為例，該探針將cpEGFP插入到人源多巴胺受體D2，通過對插入位點、連接肽段等一系列條件的優化，該探針在培養的HEK293T以及原代培養的大鼠皮層神經元中對飽和濃度多巴胺的熒光信號響應可達到90%。通過對D2受體上多巴胺結合位點的突變，得到了具有不同親和力的多巴胺探針DA1m(EC 50～130 nmol/L)和DA1h(EC 50～10 nmol/L)，用于檢測不同濃度范圍的多巴胺。GRABDA信號的上升動力學是亞秒級別的，與內源GPCR配體結合的動力學速度類似，因此，該探針具有相對較好的時間分辨率，適用于檢測內源多巴胺的動態變化。GRABDA還具有較好的分子特異性，對五羥色胺、組胺、乙酰膽堿等神經遞質沒有響應。但是，目前GRABDA對一定濃度的去甲腎上腺素仍有一定的響應，這源于去甲腎上腺素和多巴胺的化學結構非常類似，二者之間區別僅為一個羥基。此外，GPCR作為一個重要的內源信號轉導分子，在使用基于GPCR構建的探針檢測神經遞質釋放時，是否會影響細胞本身的信號通路是一個需要考慮的因素。通過對GPCR兩條主要的下游信號通路的檢測，即G蛋白和β-arrestin介導的信號通路，發現多巴胺探針的表達基本不與這兩條信號通路偶聯，其過量表達對細胞正常的生理功能沒有明顯影響[50]。這可能是因為在探針構建的過程中，一方面將D2受體的ICL3截短，另一方面將空間占位的cpEGFP插入到ICL3，影響了下游G蛋白和β-arrestin與胞內環的相互作用，最終導致探針與下游信號通路的去偶聯。綜上，此探針可在不影響細胞正常生理功能的情況下檢測內源多巴胺的釋放。GRABDA不僅可在急性小鼠腦片檢測由電刺激引起的伏隔核內源多巴胺的釋放，而且還通過構建轉基因果蠅將GRABDA特異地表達在果蠅蘑菇體(Mushroom body，MB)的單顆多巴胺神經元檢測電刺激引發內源多巴胺的釋放。除此之外，GRABDA成功地在活體小鼠中檢測到不同情況下內源多巴胺的釋放，包括光遺傳刺激、聯合型學習、性行為等。基于類似的原理，來自UC Devis的Tian課題組基于多巴胺GPCR受體D1開發了可檢測多巴胺的一系列探針dLight，與D2受體相比，D1受體對多巴胺的親和力較低，但對于多巴胺和去甲腎上腺素的區分度稍高，因此dLight探針也保留了這些特性[51]。 GRAB以及dLight系列的探針都是可遺傳編碼的，為活體應用提供了便利，可通過病毒注射或者構建轉基因動物的方法將探針表達在目的區域，也可通過一系列遺傳學手段和工具將該探針表達在特定類型的細胞中。除此之外，此系列的探針都具有較高的分子特異性、高靈敏度、高信噪比以及時空分辨率，為研究內源神經遞質的釋放提供了強有力的工具。

3 總結與展望

神經遞質作為大腦中一類重要的信息傳遞分子，參與了多種生理過程，神經遞質的釋放與調節出現異常時，可引發多種疾病。因此，精確地檢測生理與病理過程中神經遞質的釋放與調控，可更好地理解某些疾病的發病機理，并為臨床治療奠定基礎。然而， 神經遞質釋放模式、時間空間及化學性質的復雜性，給神經遞質的研究帶來了重重阻力。首先，神經遞質的釋放模式可分為緊張型釋放(Tonic release)和相位型釋放 (Phasic release)，通常，緊張型釋放是由神經元的自發性活動引起的，而相位型釋放則與神經元動作電位的成簇發放有關[11]。其次，某些神經遞質的結構和化學性質比較類似，如單胺類的神經遞質多巴胺和去甲腎上腺素，不論是電化學方法，還是可遺傳編碼的探針，對其區分度都有限。此外，還存在不同神經遞質在同一腦區同時釋放的情況。這些都增加了檢測神經遞質的難度[52]。

傳統的檢測神經遞質釋放的方法包括基于生化的微透析法、基于電化學原理的安培法和快速掃描循環伏安法存在時空分辨率不夠高、分子特異性比較低等問題; 檢測下游報告基因的Tango assay存在時間分辨率較低、背景信號較高等問題; 基于細胞系的CNiFER存在免疫排斥、操作復雜等問題; 化學遺傳探針Snifts需要外源加入帶熒光的發色基團， 不適合動物的活體研究。 基于PBP構建的可遺傳編碼的神經遞質熒光探針既保證了探針與神經遞質之間的分子特異性，又保證了探針與配體之間的親和力，但此方法目前可否廣泛用于神經遞質探針的構建還有待研究，因為部分神經遞質很難在細菌中找到可與之結合的蛋白，而原核生物的蛋白在真核生物中的表達及運輸也需要大量的優化工作。目前，基于GPCR激活原理已成功構建了可檢測乙酰膽堿、多巴胺和去甲腎上腺素的熒光探針，此系列探針表現出了較高的靈敏度、分子特異性和時空分辨率，可在果蠅、斑馬魚和小鼠等多種模式生物的不同行為范式中特異性地檢測相應神經遞質的釋放。同時，基于GPCR構建的神經遞質探針相較于基于PBP構建的探針存在以下優勢: 大多數的神經遞質都有相應的GPCR受體，較容易找到探針的骨架蛋白; 根據解析出來的GPCR晶體結構，其構象變化相對保守，因此該原理普適于開發神經遞質的探針。此外，通過改變熒光蛋白的顏色，可進一步拓寬神經遞質探針的光譜，開發紅色、藍色等不同顏色的探針，用于多色成像研究不同神經遞質之間的相互調節。 隨著各種新型遺傳工具的發展(如AAV(Adeno-associated virus)病毒和CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)技術)，以及顯微成像技術的發展(如大視場顯微鏡和三光子顯微鏡)，可在哺乳動物(包括非人靈長類)中運用神經遞質探針，實現同時多色大范圍對內源神經遞質釋放的檢測，為研究生理和病理情況下各種神經遞質的釋放與調控奠定基礎，使得最終解釋人類大腦的工作機制成為可能。