交聯透明質酸鈉凝膠研究進展

蘇江偉，張 燕，吳萬福，李 漫，楊瑩瑩，劉建建，穆淑娥，郭學平

(華熙生物科技股份有限公司，山東 濟南 250101)

1 引言

水凝膠有許多獨特的特性可以應用于組織工程領域，如與組織胞外基質相似性、可以支持細胞的增殖和遷移、控制藥物和生長因子的釋放，對周圍組織的機械破壞小[1]。透明質酸(Hyaluronic acid，HA)是一種天然粘多糖，因其分子量巨大，表現出獨特的粘彈性、優越的生物學形容性和可解性，被視作理想的組織工程材料。由于天然HA水凝膠穩定性差、對透明質酸酶和自由基敏感、在體內保持時間短、機械強度差，但通過對其進行化學修飾和交聯，增強了凝膠力學強度、穩定性和抗降解性能，使其在體內可以維持更長時間，進而獲得了一系列新型的具有生物活性和功能性的HA凝膠，擴大了其在生物醫藥和組織工程領域的應用。除了在傳統的眼科手術和關節疾病、術后防粘連、軟組織填充領域的應用，近年來HA凝膠因其特有的粘彈性逐漸應用于藥物和蛋白載體系統、細胞培養支架、術后創傷愈合等領域[2]。

2 HA的化學修飾和交聯位點

通過多樣的化學修飾和交聯反應可以改變HA凝膠的物理和化學性能達到預期目的。不同的修飾位點和方式可以得到性能多樣的凝膠。與天然HA凝膠相比，交聯凝膠衍生物在物理和化學性能有明顯的提升，但其生物相容性和生物可降解依然沒變。正是基于這一點，對HA進行修飾的研究越來越深入，HA鏈上可以被修飾的位點有：羥基、羧基和乙酰氨基[3]，其中羥基和羧基的修飾為當下熱點(圖1)。

羥基的修飾主要有四種形式：醚鍵、酯鍵、半縮醛反應、氧化反應[2]。傳統的交聯劑有：1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)、二乙烯基砜(DVS)、戊二醛(GTA)等都可以與HA的羥基反應。BDDE作為制備HA凝膠最常用的交聯劑，在堿性條件下環氧基團開環與HA羥基反生反應形成醚鍵[4]，此法制備HA凝膠多用于美容填充領域，并且已有許多產品上市，如Restylane、Juvederm、潤百顏等，是交聯HA凝膠應用最活躍的領域；DVS作為交聯劑可以在室溫下進行交聯反應形成醚鍵，制備的凝膠大大提高了其在堿性條件下的抗降解能力[5]；GTA在酸性條件下與羥基反應生成醚鍵，但酸性條件下的交聯反應并不穩定并且凝膠容易水解[6]；辛烯基琥珀酸酐(OSA)在堿性條件下與HA的羥基反應形成酯鍵[7]；甲基丙烯酸甲酯在堿性條件下通過酯化反應修飾HA，甲基丙烯酸甲酯接枝到HA主鏈上可進行下一步的光交聯[8]；高碘酸鈉通過氧化HA的羥基打開六元環形成二醛，這種醛基化的HA可以作為席夫堿反應的前體，可進行下一步交聯反應[9]。

圖1 透明質酸鈉的主要修飾位點

羧基端的修飾反應主要是羧基和氨基基團反應形成酰胺鍵。整個反應一般有兩個過程：首先是羧基基團的活化，活化劑與羧基基團生成一種加成物，隨后氨基基團作為親核基團攻擊活化加成物形成不含活化劑的交聯鍵。如己二酸二酰肼(ADH)與經碳二亞胺(EDC)活化的HA羧基基團反生形成酰胺鍵制備交聯HA凝膠[3]；呋喃甲胺經N-羥基丁二酰亞胺(NHS)活化后與羧基形成酰胺鍵修飾HA[10]。

3 交聯透明質酸凝膠的制備

設計一款用于組織工程和生物醫藥領域的凝膠需要考慮到多方因素，如生物相容性、抗降解性能、機械性能(硬度)、孔隙率(物質滲透和氣體交換)和持水性能等。基于這些因素的需求，越來越多的交聯方式被開發應用，如席夫堿反應、硫醇修飾HA、狄爾斯-阿德爾反應、疊氮化物-炔反應、酶催化交聯HA、溫敏型凝膠、光交聯等，其中席夫堿反應、硫醇修飾HA、狄爾斯-阿德爾反應、疊氮化物-炔反應都屬于點擊化學范疇。

3.1 席夫堿(Schiff-base)反應交聯凝膠

得益于溫和的反應條件和較快的反應速度，HA通過席夫堿反應制備凝膠的方式逐漸被關注[11]。席夫堿反應一般的反應方式是酮基或醛基與胺發生縮合反應，其反應溫和且制備的凝膠可以作為蛋白藥物載體和細胞支架。

Huaping Tan等[12]通過EDC和HOBt活化后與乙二胺偶聯得到氨基修飾的HA(HA-NH2)，并且用高碘酸鈉氧化乙二醇與HA反應得到醛基修飾的HA(HA-CHO)。HA-NH2和HA-CHO在室溫下發生席夫堿反應進行初步交聯形成凝膠(如圖2)，京尼平與HA-NH2的氨基反應進行二次交聯。經兩次交聯后的凝膠生物相容性良好，內部網絡更致密，抗壓能力更強，持水能力沒有改變，其抗降解能力突出，在透明質酸酶的作用下，可以維持4周，該凝膠可以作為注射類支架用于組織工程。Elena Martínez-Sanz等[13]制備了一種載藥凝膠用于骨增長。HA的羧基經EDC、HOBt活化后將3-氨基-1,2-丁二醇接枝于HA羧基端，形成的衍生物又經高碘酸鈉氧化形成HA醛基衍生物。該衍生物又與酰肼化的HA在PBS中發生席夫堿反應30 s內交聯形成凝膠，成膠速度非常迅速。同時該凝膠在PBS中浸泡24 h后仍有260 Pa的彈性模量，說明在水中不易分解和分散，這類凝膠作為藥物載體可以延長藥物半衰期。同樣HA也可與一些多糖類反應形成凝膠。Takuro Hozumi等[14]將碳酰肼修飾的明膠與醛基修飾的HA通過席夫堿反應制備凝膠，比較了碳酰肼修飾的明膠與單醛基修飾的HA(Gel-CDH/HA-mCHO)、明膠與雙醛基修飾的HA(gelatin/HA-dCHO)、己二酸二酰肼修飾的明膠與雙醛基修飾的HA(Gel-ADH/HA-mCHO)、碳酰肼修飾的明膠與雙醛基修飾的HA(Gel-ADH/HA-dCHO)抗降解性能，發現Gel-CDH/HA-mCHO抗降解性能遠遠超出其他凝膠，而并非交聯度最大的Gel-ADH/HA-dCHO，可能是由于雙醛基是六元環氧開環形成的，酸性條件下更容易發生半縮醛水解，生理條件下也容易發生β消除進而導致糖鏈斷裂。該凝膠中有15-50 μm的小孔可以有效提高細胞的增殖效率，增強細胞的適應性，適合作為細胞支架誘導細胞生長。

席夫堿系統可以完全避免額外有毒交聯劑和引起組織不良反應的觸發劑的加入。雖然該系統的易用性可以有效轉到臨床產品中但其凝膠的pH敏感性限制了它的應用[15]。席夫堿反應形成的亞胺基團在酸性條件下容易被水解，所以不能被應用于對凝膠穩定性要求較高的產品中[16]。

圖2 Huaping Tan等運用席夫堿反應制備交聯凝膠

Fig.2 Synthesis of crosslinking HA-gels vis Schiff base reaction by Huaping Tan

3.2 硫醇修飾的HA凝膠

在氧化狀態下，一些硫醇化的聚合物在聚合物鏈間常常形成二硫鍵發生自交聯，這個特性可以用來制備交聯HA凝膠。這類反應之所以備受關注不僅是因為反應溫和、便利，還在于凝膠的雙降解性，即凝膠可被透明質酸酶和還原性物質降解如谷胱甘肽、半胱氨酸等[17]。Shaoquan Bian等[18]將半胱胺鹽酸鹽接枝到HA羧基端(如圖3)，得到的HA衍生物溶于水后與空氣中的氧反應1 h，即得自交聯的HA凝膠。這類反應不引入其他化學物質交聯劑和副產物，并且凝膠化時間、溶脹度、機械性能都可控，可以作為細胞培養的支架。凝膠的降解過程中還原型谷胱甘肽的加入可以加速凝膠的去凝膠化，當該凝膠作為細胞支架時，可以通過控制谷胱甘肽的加入進而加快去凝膠化，有效控制了細胞的釋放速度。Thomas I等[19]將經硫醇基團修飾后的HA與氧化型谷胱甘肽通過硫醇-二硫化物交換反應，4 mM的GSSG與0.4%的硫醇修飾的HA在5 min內就可以反應形成凝膠。利用硫醇-二硫化物交換反應可以將蛋白中半胱氨酸的硫醇鍵與HA上的硫醇鍵共價交聯，使一些與硫醇相容的多肽或蛋白可以連接到HA鏈上，這就為藥物蛋白的緩釋載體研究提供了新方向。

雖然這個過程反應條件溫和、反應速度快，但在有還原性物質存在下凝膠中的二硫鍵容易被打斷反生去凝膠化，影響了其在對凝膠抗降解性能要求高的領域應用[20]。

圖3 半胱氨酸接枝到透明質酸羧基端

Fig.3 Grafting the cysteine to the carboxyl of HA

邁克爾加成反應的是堿性條件下硫醇類與不飽和羰基的親核加成反應，α,β不飽和酯類、乙烯基砜、馬來亞酰胺常被連接到HA骨架上與硫醇發生交聯反應。Chixuan Liu等[21]通過胱胺二鹽酸鹽的介導將表焙兒茶素-3-O-沒食子酸(EGCG)接枝到HA主鏈上。首先他們活化HA后將胱胺二鹽酸鹽接枝到HA鏈上，經三(2-羧乙基)膦打斷二硫鍵后，EGCG上的醌基與硫醇基在30 °C、pH 7.4的環境下發生邁克爾加成反應并連接到HA鏈上。得到的HA凝膠(HA-EGCG)具有清除自由基的作用，并且可以抑制透明質酸酶的酶活。為了進一步反應增強凝膠的抗酶解性能，通過辣根過氧化物酶催化的氧化偶聯反應，得到交聯HA-EGCG凝膠抗酶降解性能進一步增強。降解實驗顯示體外降解凝膠維持了20天、老鼠體內實驗維持了56天，并且組織學和血液學分析表明該注射該凝膠引起的炎癥反應很小。溫和的反應條件、優越的抗降解性能和較小的不良反應使該凝膠在組織工程領域有廣闊的應用前景，尤其作為注射凝膠用于醫療美容行業。

3.3 狄爾斯-阿德爾反應(Diels-Alder)反應交聯凝膠

狄爾斯-阿德爾反應是共軛二烯與取代烯烴的共價耦合反生的[4+2]環加成反應，反應高效、條件溫和并且不需要催化劑。雖然反應條件溫和、容易控制凝膠的機械性能但凝膠的成膠時間長影響著該方式的應用。Feng Yu等[22]通過酶催化交聯和DA反應兩步交聯制備了一種用于軟組織工程的凝膠。他們將呋喃甲胺和酪胺共同接枝到HA鏈上，同時加入二馬來亞胺，在辣根過氧化物酶和DA反應的共同作用下，形成HA雙交聯結構的凝膠。該方法解決了酶催化交聯的凝膠機械性能差、DA反應交聯的凝膠成膠時間長的問題。其中，酶催化反應在5 min內完成，凝膠存儲模量和壓縮形變分別達到了27 kPa和81.9%，反應迅速、良好的機械性能和形變恢復能力使該凝膠在作為細胞傳遞系統用于軟骨組織工程具有明顯優勢。Dongming Xing等[23]將甲基丙烯酸酯和呋喃甲胺接枝到HA鏈上，通過硫醇-烯烴反應(屬于邁克爾加成反應)將一種層粘連蛋白源多肽CQAASIKVAV聯結到HA鏈上(如圖4)；再通過二馬來亞酰胺PEG與呋喃基團反生DA反應形成交聯凝膠，從而制備了一種藥物蛋白凝膠。該凝膠可以控制甲基丙烯酸、呋喃甲胺的修飾度來控制蛋白含量和凝膠的機械性能，進而控制蛋白釋放速率，為HA凝膠在細胞培養支架和載藥方面提供一種新模式。

圖4 Dongming Xing等運用狄爾斯-阿爾德反應制備交聯HA凝膠

Fig.4 Synthesis of crosslinking HA-gels vis Diels-Alder reaction by Dongming Xing

3.4 疊氮化物-炔反應交聯凝膠

銅催化的疊氮化物-炔1,3-偶極環加成反應，形成1,2,3-三唑環。該反應的易用性表現在其高回收率、副產物低毒性、反應在生理條件下即可完成，并且該反應的催化劑可以是細胞中氧化反應產生的Cu(I)離子。Akira Takahashi等[24]利用環辛炔分子內環張力可以促進[3+2]環加成反應而不需要催化劑的特性，與疊氮化物反應制備HA凝膠(圖5)。作者通過一系列的化學反應設計分別得到了得氮化物修飾的HA(HA-A)和環辛炔修飾的HA(HA-C)。HA-A和HA-C溶液用雙管的注射器混合后注射到體內，交聯反應在生理條件無催化劑作用下即可完成，成膠時間主要取決于交聯HA的濃度，5%濃度的HA在5 min內即可成膠。該凝膠體外的PBS中可以維持2周，在透明質酸酶存在的情況下可以維持9天，在牛血清存在的細胞培養基中可以維持4天，并且細胞相容性實驗表明HA-C和HA-A具有良好的生物相容性而且其毒性與HA相同，因此該凝膠可以應用于細胞支架和細胞支持配體等領域。Shuangli Fu等[25]利用疊氮化物-環辛炔反應制備了一種HA/PEG共聚物凝膠，在生理條件下環辛炔修飾的HA與疊氮化物修飾的PEG反應迅速，只需要改變兩者的比例就能得到不同性質的凝膠。疊氮化物與環辛炔反應形成的化學鍵較為穩定，這就使制備的凝膠有更好的機械性能和抗降解能力，從而在外科手術填充材料領域有廣闊的應用。

圖5 疊氮化物與環辛炔反應

3.5 酶催化交聯的HA凝膠

酶交聯反應是一種酶催化的氧化反應，是一種非常常用的凝膠制備方式。這類反應過程是在生理條件下完成，這更符合組織工程凝膠的要求；其次該反應具有高度的生物相容性。一些由蛋白、膠原和明膠與HA組成的復合凝膠可以通過酶反應制備交聯凝膠。如谷氨酰胺轉移酶能夠介導氨基和羧基反應形成酰胺鍵，可以用于復合凝膠的制備。但是酶交聯制備的HA凝膠的一般機械性能較差，并且抗降解性能不佳，可能跟酶促反應本身有關[11]。為改變這一狀況，Nicole R.Raia等[26]用絲素蛋白與酪胺化的HA通過辣根氧化酶催化兩個酪胺基團反應形成復合交聯凝膠，通過交聯反應該凝膠被賦予了絲素蛋白的機械性能和HA的生物學性能。該系統在20 min內即可反應形成凝膠，并且其存儲模量高，表現出優秀的機械整體性和抗酶解性能，并且通過改變HA含量可以控制成膠時間、降解速率和凝膠粘彈性。硫醇化的HA凝膠在體內2周之內就降解完全，酪胺交聯的HA可以維持1個月，絲素蛋白HA復合凝膠15周后仍能保持形狀。絲素蛋白和HA的不同配比會導致不同的降解時間，降解時間的可控可以使該凝膠有不同領域的應用，如組織再生領域、藥物傳遞系統等。

3.6 溫敏型HA凝膠

由于在一定溫度下一些聚合物會改變溶解狀態和發生相位轉變，由溶液狀態會轉化成凝膠態。這一特性被用來制備的水凝膠在室溫條件下呈現出液體狀態發，在生理溫度下轉變為凝膠態。例如，Huaping Tan等[27]將聚異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)接枝到HA上制備出一種共聚物凝膠，在30 ℃下，從液態轉換成凝膠態只需要1 min。并且這種凝膠的抗酶解性能強，體外降解實驗顯示在透明質酸酶的存在下該凝膠可以維持28天。這種特性適用于將細胞封裝到凝膠中并作為細胞支架。Gert-Jan A.ter Boo等[28]介紹了一種用于外科手術的溫敏型載藥凝膠，將聚N-異丙基丙烯酰胺接枝到HA鏈上，形成一種共聚物凝膠。在25 ℃下呈現出溶膠狀態，可以將慶大霉素分散均勻，與組織接觸后迅速變成凝膠狀。因為常溫下處于溶膠狀態，能夠在手術傷口部位分散均勻，解決了普通抗生素載藥材料空間分布不均勻的問題，并且可以應對各種復雜傷口的要求，有效防止了傷口感染。

3.7 光交聯凝膠

光交聯的主要原理是在可見光或紫外的照射下，光引發劑產生自由基進而引起的聚合物交聯反應。通過這類反應可以制備植入型凝膠，凝膠前體和引發劑植入到缺陷部位，然后強光透皮照射形成交聯凝膠。常見的交聯反應主要是將丙烯酸類基團、酰胺基團、硫醇-烯基團通過光引發形成共價交聯制備交聯凝膠。

圖6 Patrick E. Donnelly等運用光交聯

Liming Bian等[29]利用光交聯技術制備了一種穩定的3D HA凝膠作為干細胞支架用于軟組織再生。他們將甲基丙烯酸酐接枝到HA鏈上，并以2-甲基-1-[4-羥乙基苯基]-2-甲基-1-丙酮作為光引發劑制備交聯凝膠。作為干細胞支架，凝膠的交聯度不僅影響凝膠的機械性能和大分子擴散性，還影響軟骨基質含量、基質的分散和基質的鈣化等。低交聯度的凝膠能更好的實現軟骨基質的空間均勻分布，通過改變HA含量和光照時間控制凝膠在合適的交聯度，在5%的HA含量和5 min的紫外照射下迅速形成凝膠，并且成功誘導骨髓間充質干細胞的增生和分化。Patrick E.Donnelly等[30]介紹了一種可調節機械性能的光交聯凝膠用于關節軟骨組織修復。作者設計用酪胺修飾HA的羧基基團，得到的HA衍生物(HA-TA)用核黃素作為光引發劑經紫外照射后得到酪胺自交聯的凝膠(圖6)。通過改變核黃素和HA-TA的濃度、紫外照射時間控制凝膠的機械性能。經紫外照射后凝膠的最短成膠時間為2.5 min，凝膠的存儲模量可以從5 Pa達到16 kPa，相比于酶催化的HA-TA，核黃素光交聯系統制備的凝膠機械性能更強。在核黃素光交聯系統中酪胺可以與芳香族氨基酸反應，通過這個原理作者設計了將HA-TA與關節軟骨進行光交聯反應，從而使凝膠與軟骨表面聯結。這可以應用于關節軟骨缺陷的修復、軟骨移植時增強軟骨組織和宿主組織之間縫隙的聯結。

雖然光交聯反應制備凝膠反應迅速且高效，但長時間的紫外照射會對細胞、蛋白和DNA造成不可逆的破壞，對其在組織工程領域的應用有了諸多限制。

4 展望

本綜述著重介紹了一系列通過化學修飾和交聯制備基于透明質酸的水凝膠。交聯后的HA凝膠在機械性能、生物可降解性和細胞相容性等方面明顯提升，對其在細胞支架、生物活性分子的載體和創傷愈合等方面的應用提供了保障。隨著技術革新交聯方式由傳統的交聯方法(BDDE等)逐漸向簡單化、可控化、智能化的交聯方式轉變。應用領域的不斷擴大，HA交聯凝膠越來越受到關注，也將得到更廣泛的應用。