槲皮素衍生物合成及其抗氧化性研究

陳佳琪，杜曉倩，范雪毅，周琛凱，饒桂維，王 磊

( 1.杭州師范大學(xué) 錢江學(xué)院，浙江 杭州 310018；2.浙江樹人大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310015 )

1 研究背景

槲皮素(Quercetin，Qe)，化學(xué)命名為 3,5,7,3',4'-五羥基黃酮，屬于黃銅醇類化合物[1]。具有心血管保護(hù)[2-3]、抗氧化[4-6]、抗腫瘤[7-10]和抗血小板聚集[11-12]等生物活性。目前，對于槲皮素的應(yīng)用越來越多，對其的衍生物合成方面也有很多的研究。但大多都是用聚乙二醇將槲皮素進(jìn)行包埋。我們的研究擬對槲皮素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，與聚乙二醇(PEG-2、PEG-4、PEG-6、PEG-1000、PEG-10000)進(jìn)行合成，運(yùn)用化學(xué)的方法將聚乙二醇連接到槲皮素的其中一個羥基上，可得到水溶性更高、分子量更大、生物利用度高、生物活性好的產(chǎn)物，其在體內(nèi)的停留的時間更久，發(fā)揮藥效時間更長。

2 研究方法

2.1 儀器與試劑

儀器：高效液相分析HPLC(島津LC-20A)、高速逆流色譜HSCCC(TBE300C)、 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE 52-99A上海亞榮生化儀器廠)、紅外光譜儀(德國BRUKER公司)、TJ270-300紅外分光光度計、UV-2600紫外可見分光光度計(上海奧析科學(xué)儀器有限公司)。

試劑：槲皮素，無水碳酸鈉，PEG-2(PEG-4、PEG-6、PEG-1000、PEG-10000)，DMF，氯仿(分析純)，甲醇(分析純)，濃硫酸(分析純)，薄層層析硅膠(化學(xué)純)，正己烷，乙酸乙酯，無水乙醇，色譜甲醇，氯乙酸酐。

2.2 槲皮素衍生物合成

式1中PEG也或與其它位置的羥基進(jìn)行反應(yīng)

The PEG in Formula 1 may also be reacted with a hydroxyl group in other locations

用電子天平取0.10g槲皮素于干燥無水帶有磁子的三頸燒瓶中，加入8.0mL DMF和0.0967g無水碳酸鈉，三頸燒瓶先抽真空再充滿氮?dú)猓敬畏磻?yīng)在氮?dú)獗Ｗo(hù)環(huán)境下進(jìn)行，在磁力攪拌的情況下反應(yīng)1h后加入3.0mL PEG-4,同樣在氮?dú)獗Ｗo(hù)環(huán)境下反應(yīng)4h后得到槲皮素衍生物，反應(yīng)期間每2h取1.0mL定容到100mL用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測是否反應(yīng)得到槲皮素衍生物。如圖2-1(PEG-4反應(yīng)1h)和2-2(PEG-4反應(yīng)4h)。

圖1 PEG反應(yīng)1h

圖2 PEG反應(yīng)4h

2.3 溶劑體系選擇

選擇使用正己烷、乙酸乙酯、無水乙醇、蒸餾水進(jìn)行溶劑體系的配比，見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)選擇的溶劑體系

本次高速逆流色譜所需的溶劑體系在經(jīng)過多次高效液相色譜法的檢測后，最后決定使用正己烷：乙酸∶乙酯∶無水乙醇∶水=0.8∶1∶1∶1.2，此時上相：下相=1.3335。上下相峰面積分別如圖圖3、圖4。

圖3 上相液相色譜圖

圖4 下相液相色譜圖

2.4 槲皮素衍生物分離

將帶有無水碳酸鈉、DMF的槲皮素衍生物通過砂芯漏斗過濾除去衍生物中少量無水碳酸鈉，再通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行蒸發(fā)有機(jī)溶劑DMF，最后用真空耙式干燥機(jī)對旋蒸后的產(chǎn)物進(jìn)行烘干得到粉末狀槲皮素衍生物。最后在經(jīng)過高速逆流色譜儀進(jìn)行分離提純得到較為純凈的槲皮素衍生物，得到圖5。

圖5 槲皮素衍生物高速逆流色譜圖

2.5 槲皮素衍生物抗氧化性檢測[13]

抗氧化性檢測采用的是DPPH法，其溶液在 517 nm 處有最大吸收值，且與濃度呈線性關(guān)系。抗氧化劑能夠結(jié)合或替代 DPPH，使溶液吸光度變小，以1mL樣品與3mL無水乙醇混合后溶液作為空白對照，測得吸光度Ao。以1mL無水乙醇代替槲皮素衍生物溶液，測得吸光度 As。通過檢測 517 nm 的吸光度值計算物質(zhì)的抗氧化能力，測得517nm處的吸光度Ay。并按如下公式計算 DPPH 自由基清除率：

Ay：1mL 樣品溶液與 3mL DPPH 溶液混勻后的吸光度值；As：1mL 無水乙醇與 3mL DPPH 溶液混勻后的吸光度值；Ao：1mL 樣品溶液與 3mL 無水乙醇混勻后的吸光度值。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)論與分析

表2 槲皮素衍生物產(chǎn)量隨時間變化

表2(續(xù))

根據(jù)表格2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到槲皮素與PEG-4的槲皮素衍生物的產(chǎn)量較多。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)將槲皮素分別與PEG-2、PEG-4、PEG-6、PEG-1000以及PEG-10000反應(yīng)，經(jīng)高效液相色譜儀檢測峰面積后發(fā)現(xiàn)槲皮素與PEG-4得到槲皮素衍生物的峰面積得到的產(chǎn)量較多，且在4h時得到的產(chǎn)物更多，4h之后會發(fā)生副反應(yīng)，使產(chǎn)物減少。同時，分離產(chǎn)物需要在2h內(nèi)，否則產(chǎn)物氧化，槲皮素衍生物的峰面積下降，雜質(zhì)含量大大增加。