曲克蘆丁脂質體的制備及體外釋放度研究

周永芳，李林松，李 錕*，楊碩曄

(1.黃河科技學院，河南 鄭州 450063；2.河南工業大學 生物工程學院，河南 鄭州 450001)

曲克蘆丁(又稱維生素P4)可抑制血小板凝聚，防止血栓形成，改善血液循環，增加毛細血管抵抗力，治療急性缺血性腦損傷，使人體血管的一些病變得到改善；其還具有抗氧化功能，修復5-羥色胺、緩激肽等物質引起的血管損傷；曲克蘆丁腦蛋白水解物注射液能有效治療糖尿病腦梗死，提高糖尿病腦梗死的治愈率，降低其病死率[1]。

目前，曲克蘆丁有多種劑型如膠囊劑、口腔崩解片、注射劑、片劑、散劑和顆粒劑等。曲克蘆丁的水溶性和脂溶性均不好[2]，口服及注射曲克蘆丁制劑后，吸收不良，生物利用度低[3]。另外，注射劑因注射疼痛，患者依從性低，用藥不便。脂質體作為藥物載體，既可以包封水溶性物質又可以包封脂溶性物質，可增強其水溶性和穩定性，改變藥物在體內的分布情況，還可以改良藥物的吸收，提高藥物的穩定性，提高生物利用度，延長藥物作用時間[4]。

1 材料

1.1 儀器

TGL-16G臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；RE-52A旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；T6紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；Agilent LC 1260液相色譜儀(日本安捷倫科技有限公司)；G1322A標準真空脫氣機；G1312C二元泵；G1316A標準柱溫箱；G1314B可變波長檢測器；FD-1-50真空冷凍干燥機(北京博醫康實驗儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

曲克蘆丁(大連美侖生物技術有限公司)；乙腈(分析純，西隴科學股份有限公司)；10 mg/mL魚精蛋白(注射液，上海第一生化藥業有限公司)；豆磷脂95、98(注射用，上海太偉藥業有限公司)；膽固醇(美國Avanti公司)。

2 方法與結果

2.1 曲克蘆丁脂質體的制備

分別稱取大豆磷脂、膽固醇、曲克蘆丁于圓底燒瓶中，加入10 mL甲醇，旋渦混合儀震蕩5 min，超聲 30 min，再加入8 mL的水進行超聲2 h，待液相不分離的時候進行旋轉蒸發，壓力控制0.05 MPa，水浴溫度30 ℃，20 min后取出，放入超聲儀中使其分散均勻即得曲克蘆丁脂質體[5]。

2.2 曲克蘆丁脂質體包封率的測定

2.2.1 色譜條件

流動相∶V(甲醇)∶V(水)=6∶4，檢測波長：350 nm，流速：1 mL/min，柱溫：25 ℃。

2.2.2 準確度實驗

取曲克蘆丁標液(1000 μg/mL)10 μL，進樣三次，求平均值；將曲克蘆丁標液稀釋10倍(100 μg/mL)，進樣三次，求平均值。根據 計算準確度為113.8%，說明高效液相色譜的測量結果可靠性較高，數值可信。

2.2.3 回收率實驗

取標液100 μL(1000 μg/mg)，加入900 μL甲醇，得到1000 μL對照溶液，搖勻，測定。分別取標液80 μL、100 μL、120 μL，再分別加入120 μL、100 μL、80 μL魚精蛋白稀釋液，最后再加800 μL甲醇，得到1000 μL溶液，搖勻，測定。計算得80%樣品、100%樣品、120%樣品的回收率分別是100.4%、98.5%、102.4%，說明方法的回收率較好。

2.2.4 包封率的測定

采用HPLC法測定曲克蘆丁[6]：取脂質體樣品100 μL，然后加入4 mL甲醇破乳，渦旋后測定。取兩只離心管，每只離心管中分別加入100 μL脂質體溶液，再加入100 μL魚精蛋白，靜置5 min。然后加入4 mL去離子水，12000 r/min離心10 min，將上清液全部直接進樣測定，根據公式和測定數值計算包封率為14.28%。

2.2.5 冷凍干燥對脂質體包封率的影響

將放置一段時間的樣品從冰箱(4 ℃)中取出，發現溶液中有固體顆粒物析出，使用渦旋混合器和超聲波清洗機對樣品進行分散。較長時間后觀察樣品，發現固體顆粒仍然不能完全溶解，繼續用超聲波細胞破碎儀來達到目的[7]。把樣品放入冰浴中，使用細胞破碎儀進行破碎，完成后觀察樣品呈均勻溶液。將樣品倒進小燒杯(50 mL)中，然后放入凍干機進行凍干，分別測定凍干前后脂質體的包封率，結果如圖1所示。

圖1 冷凍干燥前后包封率的變化

從圖1可以看出冷凍干燥對處方11、處方13、處方14、處方16的包封率影響并不大。而處方15、處方17包封率變化較大，這可能與凍干后復溶時的操作不準確有關。

2.3 曲克蘆丁脂質體體外釋放度研究

2.3.1 測定方法

取100 mL的釋放介質放于200 mL的燒杯中，取2 mL脂質體置于透析袋中，并將兩端用細線封口，并置于以上所述的100 mL釋放介質中，當溫度達到37℃時開始啟動搖床，搖床轉動速度為85 r/min。分別在0，10，30，70 min及2，4，6，8，12 h時刻取樣，每次取樣2 mL，并及時補充2 mL釋放介質，將取出的樣品收集起來，之后測定其含量。

HPLC法測定不同時間點釋放介質中藥物的含量。同時取適量的脂質體，用甲醇破乳，測定總藥量W，并根據下面公式計算其釋放百分率[8]。

Qn=CnVo+∑CiVi(i=0～n-1) 釋放百分率(%)=Q/W 100%

2.3.2 釋放介質考察

取某一處方脂質體，分別以去離子水，PBS和生理鹽水為釋放介質，轉速為85 r/min，按照上述方法溶出后，測定其釋放度(表1)，考察其體外釋藥的情況(圖2)。

表1 不同釋放介質的釋放度

圖2 不同釋放介質釋放度趨勢圖

由表1和圖2可知，以PBS和生理鹽水為釋放介質時對釋放度的影響均大于去離子水，雖然PBS和生理鹽水的釋放度相對較大，去離子水的釋放度相對較小，但是它們做釋放介質時釋放度不夠穩定，而去離子水是相對穩定的。因此選擇去離子水作為釋放介質。

2.3.3 不同處方的釋放度比

在37℃的條件下，以去離子水為釋放介質，轉速85 r/min，分別測定處方3，處方6和處方9的釋放度，并比較其釋放度的差別[9](表2)。

表2 不同處方釋放度

由表2可知，處方9的第5組數據有明顯的波動性，數據不合理，而處方3和處方6均沒有出現這種波動，而且從整體數據來看，藥物沒有突釋現象，所以將這組數據舍去，建立一個新表格。而處方3的第一組數據不合理，是因為實驗時的不可控因素造成，且數據可以接受，所以不將其舍去(表3，圖3)。

表3 不同處方釋放度

圖3 不同處方釋放度趨勢圖

由圖3可知，三個處方釋放度曲線趨勢大致相同，而且相差較小，而且每個處方的釋放度都能達到74%之上，可見每個處方脂質體包載的藥物均能得到較好的釋放。

2.3.4 數學模型擬合

分別以零級動力學，一級動力學和Higuchi方程，Ritger-Peppas方程，Webull方程對曲克蘆丁脂質體的積累釋放曲線進行方程擬合得擬合方程如表4所示[10]。

表4 處方擬合曲線

擬合結果表明的體外釋放最優擬合均為Weibull模型。

3 結論

本研究建立的魚精蛋白凝集法在測定曲克蘆丁脂質體包封率時準確、有效、快速，可快速分離游離藥物和脂質體，從而能夠準確測定并計算得到曲克蘆丁脂質體的包封率[11]。采用冷凍干燥技術可將曲克蘆丁脂質體制成凍干樣品， 根據數據，冷凍干燥對樣品的藥物含量影響較小，同樣對樣品的包封率也沒有明顯的影響。

通過對建立釋放度測定的方法學，我們可以得出該方法專屬性強，藥物性質穩定，線性關系在一定濃度下良好，回收率高，精密度和準確度均良好。采用搖床釋放藥物的方法，選出三個處方對曲克蘆丁脂質體進行體外釋放度的研究[12]。采用的液相條件是：甲醇∶水=60∶40，檢測波長：350 nm，流動速度：1.0 mL/min，柱溫：25 ℃，進樣量：10 μL。對三個處方分別進行了零級動力學方程，一級動力學方程，Higuchi方程，Ritger-Peppas方程，Weibull擬合，擬合結果表明曲克蘆丁脂質體的體外釋放最優擬合均為Weibull模型。

實驗說明，將曲克蘆丁制備成脂質體，并不會影響曲克蘆丁藥效的發揮，且輔料不會對曲克蘆丁脂質體產生較大影響。曲克蘆丁脂質體還會增強藥物的穩定性，脂質體可以選擇性的釋放藥物，使藥物的作用靶向性增強，更有利于藥物的吸收和利用。而且脂質體的載體材料和細胞膜組成相似，對人體沒有免疫反應和毒害作用[13]。因此將曲克蘆丁制成脂質體對其發揮藥效具有很大的促進作用。但同時本實驗也有不足之處，脂質體的穩定性有待進一步提高。