循環(huán)腫瘤細(xì)胞在晚期食管鱗癌患者療效評估中的臨床價(jià)值*

李彥，胡正宇，李祥華，楊林

（安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1.腫瘤放療科，2.普外科，安徽 合肥 230032）

中國是食管癌高發(fā)的國家，每年因腫瘤死亡的患者中，約有一半為食管癌患者[1]。食管癌是中國第5 大常見的腫瘤，也是病死率排名第4 的腫瘤[2]。對不具備手術(shù)指征的患者，同步放化療為美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）指南中治療的金標(biāo)準(zhǔn)[3]。患者的外周血中存在可自發(fā)擴(kuò)散入血的腫瘤細(xì)胞，其已被定義為循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells, CTC）[4]，2007年美國臨床腫瘤學(xué)會（ASCO）將CTC 納入腫瘤標(biāo)志物，可用于證實(shí)腫瘤的存在、發(fā)病過程、評估患者的預(yù)后、識別患者接受治療后的臨床治療效果；2010年美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）將CTC 作為遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移標(biāo)準(zhǔn)[M 分期，cM0（i+）]。本研究通過監(jiān)測食管鱗癌患者外周血中CTC 的動(dòng)態(tài)變化，評估CTC 與患者預(yù)后的相關(guān)性，進(jìn)一步研究CTC 是否可作為食管鱗癌患者療效評估的指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年12月31 日—2016年12月31 日安徽 醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤放療科的食管鱗癌患者38 例。其中，男性28 例，女性10 例；年齡46～90 歲，中位年齡72 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥20 歲的患者；經(jīng)病 理或者細(xì)胞學(xué)確診為食管鱗癌；患者自身情況不適宜手術(shù)，或術(shù)前評估病灶無法切除的Ⅲ期患者；出現(xiàn)遠(yuǎn)處寡轉(zhuǎn)移的IV 期患者（任何T、N、M1、N3或T4b）；具有臨床易于觀察的可測量病灶；ECOG 評分≤2，無嚴(yán)重合并癥及放療禁忌證；患者可自行理解且自愿參加并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤的患者；放化療不耐受的患者；有嚴(yán)重的心肺肝腎功能障礙。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 治療方案

1.2.1 放療方案 儀器設(shè)備采用6 MV X 射線，使用西門子直線加速器行單純?nèi)S適行放療；所有入組患者的放療總劑量為DT：50 Gy/25 F（d1-33），1.8～ 2.0 Gy/次；GTV 包括食管癌原發(fā)病灶及腫大的淋巴結(jié)，CTV 包含GTV 及淋巴引流區(qū)；PTV：在CTV 的基礎(chǔ)上各外放0.5 cm，以及勾畫出需保護(hù)的周圍重要臟器。

1.2.2 化療方案 本研究中入組患者均采用TP 方案：紫杉醇135 mg/m2第1 天靜脈滴注；順鉑20 mg/m2第1～ 5 天；放療第1 天予以第1個(gè)周期化療，放療20 次左右行第2個(gè)周期化療，放療結(jié)束后繼續(xù)行2個(gè)周期鞏固化療，28 d 為1個(gè)化療周期。

1.3 CTC 的檢測

本研究采用陰性富集法外周靜脈血中篩檢CTC，對每位研究對象，在放療前7 d 內(nèi)，同步放化療療程結(jié)束后的7 d 內(nèi)均用真空采血管采集肘正中靜脈血，采集3.2 ml 靜脈血于ACD 抗凝管中，采血完畢后立即顛倒 混勻8 次。采集的血液在24 h 內(nèi)去除血清，裂解液去除 紅細(xì)胞，磁珠孵育混勻去除白細(xì)胞，分離液分離富集的腫瘤細(xì)胞。使用CD45 抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光檢測，8 F 著絲粒探針（CEP8）進(jìn)行免疫熒光原位雜交（imFISH），CEP ≥3/DAPI+/CD45-，也即核內(nèi)信號≥3 倍體，細(xì)胞核 DAPI 染色陽性，CD45 染色陰性定義為循環(huán)腫瘤細(xì)胞；CEP=2/DAPI+/CD45+為白細(xì)胞。見圖1。

圖1 CTC 鏡下視野

1.4 CTC 值及CTC、CEA、CA125、CA199 差值 的定義

CTC＞3個(gè)定義為CTC 陽性，CTC ≤3個(gè)定義為CTC 陰性[5-6]。放療前后CTC 的差值dCTC=放療前CTC-放療后CTC，放療前后CEA、CA125、CA199 的差值dCEA=放療前CEA-放療后CEA，dCA125=放療前CA125-放療后CA125，dCA199=放療前CA199-放療后CA199。

1.5 療效評估

根據(jù)實(shí)體腫瘤的療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)RECIST 1.1 版，選取CT 所示食管病變最大層面的食管直徑為靶病灶，評估食管癌患者同步放化療前后靶病灶直徑的變化[7]。

1.6 隨訪

對38 例患者進(jìn)行放療后維持2年的追蹤隨訪。隨訪內(nèi)容包括：體格檢查，復(fù)查常規(guī)的血液學(xué)指標(biāo)，頸、胸、腹部增強(qiáng)CT，依據(jù)檢查結(jié)果評估患者是否復(fù)發(fā)。隨訪于2019年5月1 日截止。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)分布的采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的采用中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，比較采用秩和檢驗(yàn)（Z檢驗(yàn)），患者生存率比較用Kaplan-Meier 法及Log-rankχ2檢驗(yàn)，運(yùn)用Cox 回歸模型篩選影響預(yù)后的獨(dú)立影響因素，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 放療前后CTC 和隨訪指標(biāo)的變化

本研究中38 例患者接受50 Gy 的放療劑量聯(lián)合同步化療后，靶病灶直徑均明顯縮?。≒＜0.05），考慮50 Gy 的劑量即可達(dá)到臨床緩解。放療后的CTC、CEA、CA199、CA125 與放療前比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。放療前后白細(xì)胞，血紅蛋白，白蛋白和血小板差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），腫瘤指標(biāo)下降。見表1。

2.2 CTC 值與患者預(yù)后的生存分析

放療前CTC 陰性患者與放療前CTC 陽性的患者2年生存率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.743，P= 0.098）（見圖2A）；dCTC＞0 與dCTC ≤0 患者生存曲 線提示兩者2年生存率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 10.844，P=0.001），即放療后外周血CTC 數(shù)值未增加的 患者，預(yù)后較好（見圖2B）。CEA、CA199、dCA125的取值對患者的預(yù)后無影響（見圖2C、E、H）。放療前CA125 值高于正常范圍的患者預(yù)后明顯優(yōu)于CA125值低于正常范圍的患者（χ2=15.989，P=0.000）（見圖2G），dCTC、dCEA、dCA199、放療前CA125 值對患者的2年生存率有影響。dCEA＞0，dCA199＞0 的患者生存期較dCEA ≤0，dCA199 ≤0 的患者生存期長（見圖2D、F）。

表1 放化療前后食管癌患者一般資料變化

圖2 同步放化療前后患者生存曲線比較

2.3 放化療前后CTC 患者最大直徑的比較

放化療前后CTC 患者腫瘤最大直徑比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），放療前后CTC 陽性患者靶病灶最大直徑大于CTC 陰性患者。見表2。

2.4 多因素Cox 回歸分析

將dCTC＞0、CTC＞3、dCEA＞0、dCA199＞0、放療前 CA125＞35 u/ml 值進(jìn)行Cox 回歸分析，結(jié)果顯示dCTC＞0 是食管癌患者同步放化療后預(yù)后的獨(dú)立影響因素[=3.970（95% CI：1.043，15.117），P=0.043]，放療前CA125＞35 u/ml 也是入組患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素 [=31.642（95% CI：2.939，340.656），P=0.004]。見表3。

表2 放化療前后CTC 患者最大直徑的比較

表3 同步放化療后食管癌患者預(yù)后的多因素分析參數(shù)

3 討論

對不能手術(shù)的食管癌患者，同步放化療是治療的金標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)2018年NCCN 指南，50.0～50.4 Gy 劑量即可達(dá)到根治劑量。王玉芳等[8]指出，配合足夠劑量的紫杉醇聯(lián)合放療，50 Gy 組和60 Gy 組無生存差異，且高劑量組副反應(yīng)較大，難以耐受后續(xù)化療，故本研究予以入組患者的放療劑量為50 Gy，放療后患者靶病灶最大直徑與放療前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮50 Gy 即可達(dá)到有效局控，患者的CTC 值同樣有差異，即50 Gy 劑量，患者血液循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞較治療前明顯減少，認(rèn)為該治療方案有效。

本研究發(fā)現(xiàn)食管癌患者經(jīng)過50 Gy 劑量放療，聯(lián)合TP 方案同步化療后，CTC 值較治療前總體降低，與許剛等[5]對食管癌患者同步放化療后CTC 值變化相致，LIU 等[9]對食管癌手術(shù)患者也有相同發(fā)現(xiàn)，手術(shù)患者術(shù)后和術(shù)后3 天外周血中CTC 的含量較術(shù)前都下降。再次驗(yàn)證50 Gy 的劑量即可改善患者病情，局部控制腫瘤進(jìn)展，為有效的治療。

國內(nèi)外已有多項(xiàng)研究表明，CTC 與胸部腫瘤預(yù)后具有明顯相關(guān)性[10-12]，對食管癌的患者，國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)提示CTC 可以作為判斷食管癌預(yù)后的獨(dú)立影響因素[13]。許剛等[5]認(rèn)為，對食管癌患者放化療前后的CTC 均與患者的預(yù)后密切相關(guān)，本研究結(jié)果提示食管癌放療前CTC 與患者的預(yù)后相關(guān)性欠佳，經(jīng)同步放化療后，放療前后CTC 的差值與患者預(yù)后明顯相關(guān)，即食管癌局部晚期患者經(jīng)同步放化療后，CTC 值減少的患者預(yù)后較好，CTC 未見減少甚至增加的患者預(yù)后欠佳。經(jīng)Cox 多因素分析顯示，dCTC 為判斷食管癌患者放化療后預(yù)后的獨(dú)立預(yù)后影響因素。CEA、CA199、dCA125 雖與患者的預(yù)后相關(guān)，但不能作為患者的預(yù)后獨(dú)立影響因素，需結(jié)合其他指標(biāo)共同判斷。得到本結(jié)果的原因可能較放療前CTC 的值，dCTC 更能體現(xiàn)治療過程中CTC 值的動(dòng)態(tài)變化，更能體現(xiàn)治療在改善患者預(yù)后中的重要作用，即患者得到可改善預(yù)后的治療后，CTC 值較前減少，預(yù)后得到改善。

本研究中的血清學(xué)指標(biāo)CEA、CA125、CA199 均為消化道腫瘤的重要的腫瘤標(biāo)志物，CA125 最早用于評估卵巢癌患者的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，同時(shí)也被多項(xiàng)研究指出可作為評估食管癌發(fā)生、發(fā)展的重要指標(biāo)[14-15]。ZHAO 等[16]在其研究中指出CA125 可以預(yù)測食管鱗癌患者淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，血行轉(zhuǎn)移，并是獨(dú)立預(yù)后影響因素，且優(yōu)于CA199 和CEA。在本研究中，通過對放療前后腫瘤指標(biāo)值的對比發(fā)現(xiàn)，放療前CA125 值也可以作為食管癌患者同步放化療后的患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素，與患者的預(yù)后密切相關(guān)。這可能與腫瘤細(xì)胞不僅可以合成CA125,且能主動(dòng)將其分泌到細(xì)胞外相關(guān)[17]，仍需更大樣本量及專項(xiàng)的研究探討。

綜上所述，放療前后CTC 的差值，放療前CA125值可作為食管癌III、IV 期接受同步放化療治療患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素，本實(shí)驗(yàn)仍有許多不足，納入患者的樣本量尚有限，目前正在入組更多的患者，更大樣本的實(shí)驗(yàn)正在設(shè)計(jì)中，同時(shí)將對患者進(jìn)行更長時(shí)間的隨訪，日后將進(jìn)行更深一步的探討。