鈣激活中性蛋白酶2在口腔鱗狀細胞癌中的表達及對腫瘤細胞生物學行為的影響

鄭博，廖湘凌，丁南，王敬國，龐曉霞

（首都醫科大學附屬北京潞河醫院 口腔科，北京 101100）

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）是人頭頸部惡性腫瘤中常見的病理類型之一，占世界癌癥死亡率的第6 位[1]。鈣激活中性蛋白酶2（calcium activated neutral protease 2, Calpain-2）是鈣依 賴性半胱氨酸蛋白水解酶家族成員，廣泛表達在哺乳動物中。研究表明，Calpain-2 高表達與基底樣或三陰性乳腺癌的不良結果相關[2]。同時，Calpain-2 高表達 也與卵巢癌患者的鉑耐藥性和較差的總體存活率相關[3]。有文獻報道，組織中的鈣激活中性蛋白酶對某些腫瘤細胞的遷移能力有明顯影響[4]。本研究檢測OSCC 患者癌組織與癌旁組織中Calpain-2 的表達量，并進行比較，統計分析OSCC 組織Calpain-2 的表達及對5年生存率的影響。同時，利用shRNA 技術構建OSCC 低表達Calpain-2 的細胞系，研究Calpain-2 對OSCC 腫瘤細胞生物學行為的影響。

1 資料與方法

1.1 組織及細胞樣本

選取2011年3月—2014年3月首都醫科大學附屬北京潞河醫院口腔科進行外科手術并確診為OSCC患者的癌組織74 例，取距離癌組織≥5 cm 的癌旁組織作為對照組。HSC3、HSC6 細胞購自日本生物研究資源細胞庫。OSCC 細胞為貼壁生長，用DMEM 培養基+10%胎牛血清，放置在37℃、5%二氧化碳CO2孵箱中培養。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學及評分標準 將OSCC 組織及癌旁組織用4%多聚甲醛固定48 h，按試劑盒說明書操作，以不加一抗為對照，受試樣一抗為Calpain-2 單克隆抗體[美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。免疫染色陽性物質均呈棕黃色顆粒，2 人雙盲法觀察切片。染色分值由2個指標衡量：一是陽性細胞率，每例隨機選擇8個高倍鏡視野，取平均值共計800個細胞，按陽性細胞數占總細胞數的比例計算陽性表達率：1 分，1%～33%；2 分，34%～67%；3 分，68%～100%。二是染色強度，1 分，弱表達；2 分，中表達；3 分，強表達。染色分值=陽性細胞率×染色強度，分值為0～9 分，＜6 分為低表達，≥6 分為高表達。

1.2.2 逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR） 使用RNAiso Reagent（日本TaKaRa 公司）試劑盒提取總RNA，用Oligo primer 和Go Script ? Reverse Transcription System（美國Roche 公司），取1 μg 總RNA 逆轉錄成cDNA，然后RT-PCR（Light Cycler 480,美國Roche 公司）用雙鏈DNA 特異SYBR Green I Dye 檢測Calpain-2 的表達。具體反應體系參照試劑盒說明書，總體系20 ml，95℃預變性5 min，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，共45個循環。Calpain-2 正向引物：5'-GCTGCCGTTTG CTGAGTGTC-3'；反向引物：5'-CGGTCACAGAGTAGG CATGG-3'。長度120 kb。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶 （GAPDH）為內參，GAPDH 正向引物：5'-AACTTTGGC ATTGTGGAAGG-3'；反向引物：5'-ACACATTGGGGG TAGGAACA-3'。長度310 kb。

1.2.3 Western blotting 用RIPA 裂解液裂解OSCC樣本或細胞系，加入5×上樣緩沖液95℃ 3 min，提取總蛋白，10% SDS-PAGE 電泳，分離蛋白樣本，以抗人Calpain-2（美國Abcam 公司）單克隆抗體4℃孵育過夜。過氧化物酶連接的抗小鼠二抗（CST）常溫孵育2 h 后，以HRP 化學發光液（美國Mllipore 公司）觀察蛋白表達量。

1.2.4 shRNA 轉染 OSCC 細胞系以2×105個/孔接種到6 孔板中。待細胞貼壁后用凝聚銨溶液每孔轉染5 mg Calpain 2-shRNA 載體或對照載體。轉染48 h后，將細胞消化下來重新鋪到15 cm 培養皿中，加入0.5 mg/ml 嘌呤霉素的細胞培養基進行培養。2 周后，分離出單個克隆并接種到96 孔板中進一步篩選。2個月后可以篩選出具嘌呤霉素抗性的穩轉系，繼續在含1 mg/ml 嘌呤霉素的培養基中培養。

1.2.5 細胞增殖實驗 Calpain-2 shRNA 轉染后的OSCC 細胞系以5×103個/ml 接種到96 孔板中，培養24、48、72 和96 h 后，用Cell Counting Kit-8（CCK-8，美國Sigma 公司）檢測細胞生長情況。每孔加入10 μl CCK-8 37℃孵育3～4 h 后，用450 nm 處的光密度（OD）值減去減去650 nm 處的背景進行測量染色。

1.2.6 細胞遷移實驗 將細胞重懸在無血清DMEM培養基中，按1.5×105個/孔將用Cell Trace 標記的細胞 鋪在Transwell 小室的上層，下層放置500 ml 含10% FBS的DMEM培養基，放置在37℃、5% CO2孵箱中培養。24 h 后將細胞固定，熒光顯微鏡下400 放大倍數計數細胞，計5個視野，取均值。

1.2.7 細胞凋亡實驗 OSCC 細胞轉染Calpain-2 shRNA 48 h 后，用FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit（美國BD 公司）檢測細胞的凋亡情況。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗；計數資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗；生存分析用 Kaplan-Meier 法，采用Log-rankχ2檢驗；P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OSCC 組織及癌旁組織Calpain-2 的表達

Calpain-2 在OSCC 組織中的表達較癌旁組織高（χ2=99.925，P=0.000）。74 例早期OSCC 患者中，57 例（77.03%）Calpain-2表達于細胞質，其中，38例為高表達，19 例為低表達；56 例（75.68%）Calpain-2 表達于細胞膜，其中，30 例陰性，26 例陽性；30 例于細胞質和細胞膜共同表達。見圖1。

2.2 OSCC 組織及癌旁組織的Calpain-2 mRNA和Calpain-2 蛋白表達

RT-PCR結果顯示，OSCC組織的Calpain-2 mRNA相對表達水平為（4.81±0.14），癌旁組織為（1.15± 0.08），兩組比較，差異有統計學意義（t=195.259，P= 0.001），OSCC 組織的Calpain-2 mRNA 水平較癌旁組織上調。Western blotting 顯示OSCC 組織的Calpain-2表達高于癌旁組織。見圖2。

圖1 OSCC 組織及癌旁組織Calpain-2 表達 （免疫組織化學 ×200）

圖2 OSCC 組織與癌旁組織的Calpain-2 的 表達情況比較

2.3 Calpain-2 表達與總體生存率的關系

74 例患者5年死亡33 例（44.59%），存活41 例（55.41%）。Calpain-2 在細胞膜中陰性與陽性5年生存率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）（見表1）。

2.4 轉染Calpain-2 shRNA 的OSCC 細胞系中Calpain-2 的表達

與對照組比較，Calpain-2 敲低的穩轉OSCC 細胞系中Calpain-2 表達降低（P＜0.05）。見圖3。

表1 Calpain-2 表達與OSCC 患者5年生存率的關系

2.5 轉染Calpain-2 shRNA 的OSCC 細胞系細胞的生長情況

轉染Calpain-2 shRNA 后，OSCC 細胞系（HSC3）在100 h 的OD 值為（3.1±1.0），與轉染陰性對照細胞 的Control shRNA OD 值（2.8±0.9）比較，差異無統計 學意義（t=1.918，P=0.060）。見圖4。

2.6 穩轉Calpain-2 shRNA 的OSCC 細胞系細胞 的凋亡情況

以Calpain-2 shRNA 穩轉的OSCC 細胞系（HSC6）凋亡率為（9.83±1.57）%，與對照細胞系的凋亡率 （10.13±0.94）% 及其Annexin V單陽性細胞和Annexin V/PI 雙陽性細胞比較，差異無統計學意義（t= 1.410，P=0.163）。見圖5。

2.7 穩轉Calpain-2 shRNA 的OSCC 細胞系細胞 的遷移情況

低表達Calpain-2 的穩轉OSCC 細胞系遷移率（58.1±2.98）%與對照細胞系（15.56±6.07）%比較，差異有統計學意義（P＜0.05）（見圖6）。在接種至培養皿48 h 后，遷移的細胞數量降低63.3%。

圖3 Calpain-2 敲低的穩轉OSCC 細胞系中 Calpain-2 的表達

圖4 轉染Calpain-2 shRNA 的OSCC 細胞系的生長情況

圖5 Calpain-2 敲低的穩轉OSCC 細胞系的細胞凋亡情況

圖6 以Calpain-2 shRNA 穩轉的OSCC 細胞系細胞的遷移情況

3 討論

近年來，關于Calpain 介導的蛋白水解與Calpain參與化學性和興奮毒性神經元創傷中神經元壞死的研究受到極大的關注[5]。在靜息狀態下，Calpain-1 和Calpain-2 以異質二聚體酶原（80+29）kD 的形式廣泛存在于各種細胞中。當細胞中Ca2+的含量發生異常馬上可以激活Calpain-2 和Calpain-2 發生自溶，形成異質二聚體的活化形式[6]。在生理狀態下，Calpain-2的活性受內源性的蛋白酶抑制蛋白調控[7]。在極端的情況下，Calpain-2 會被過度激活，導致細胞內Ca2+的含量持續處于高水平[8]。Calpain 反應底物包括細胞支架蛋白、漿膜-細胞膜相關蛋白信號轉導和鈣調蛋白依賴的蛋白質和轉錄因子。當少量Calpain 被活化時，上述底物蛋白被水解后，可能會轉導細胞信號或觸發細胞功能，如膜融合或細胞伸展[9]。

本研究分析多個OSCC 組織中Calpain-2 的含量，OSCC 組織中Calpain-2 表達比癌旁組織要高。Calpain-2 可能參與腫瘤細胞的發展。Calpain-2 的高表達并不是影響OSCC 患者總體生存率的獨立因素，說明Calpain-2 并非直接影響腫瘤的發展，而是通過調控其他因素促進腫瘤的發生。為進一步研究Calpain-2在腫瘤細胞中的作用，利用Calpain-2 shRNA 構建低表達Calpain-2 的OSCC 穩轉系，發現Calpain-2 敲低的OSCC 細胞的生長情況與對照組比較無差異，同時凋亡率與對照組也無差異。同時，通過細胞遷移實驗發現，降低Calpain-2 的表達能抑制細胞的遷移。根據實驗結果可以推測，OSCC 癌細胞內Ca2+的含量異常，激活Calpain-2 發生自溶形成活化狀態與胞內底物蛋白發生反應，從而轉導細胞信號或使腫瘤細胞發生遷移。已有文獻報道Calpain-2 與纖維肉瘤細胞、膠質母細胞瘤細胞、胃癌細胞等癌細胞的遷移有關[10]。本研究表明，Calpain-2 可能也參與到OSCC 癌細胞的遷移過程中，有可能成為抑制OSCC 癌細胞遷移的重要靶點。