小窩蛋白-1在白藜蘆醇治療小鼠急性肺損傷中的作用研究*

董雷，蔡宛如，馬春芳

[1.浙江中醫藥大學附屬第二醫院（浙江省新華醫院），浙江 杭州 310005；2.浙江省人民醫院，浙江 杭州 310014]

急性肺損傷（acute lung injury, ALI）是呼吸系統危重疾病。ALI 早期受損傷最明顯的結構是肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞，這些細胞損傷導致肺泡鈉水轉運失調，引起肺水腫及炎癥細胞聚集。近年來的研究表明，小窩蛋白（Caveolin, Cav）在肺泡上皮細胞屏障功能變化中扮演重要作用。本研究探討小窩蛋白-1（Cav-1）在ALI 小鼠中的變化情況以及白藜蘆醇作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

實驗用雌性BALB/c 小鼠購于浙江中醫藥大學動物實驗中心，體重（18±2）g。脂多糖（LPS）購自美國Sigma公司，型號為E.coli.O55：B5, Sigma L-2880。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）ELISA 試劑盒購自南京建成生物工程研究所，異氟烷購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司，Cav-1 單抗購自CST 美國公司。白藜蘆醇購自杭州沃森生物科技有限公司，過表達Cav-1 基因的重組慢病毒為前期實驗制備，且已在293T 細胞中驗證為過表達Cav-1。

1.2 動物分組及模型復制

BALB/c 小鼠共50 只，隨機分為正常組、ALI 組、ALI+ 白藜蘆醇干預組、Cav-1 過表達的ALI 組、Cav-1 過表達的ALI+白藜蘆醇干預組，每組10 只。ALI 組采用小鼠霧化吸入異氟烷，麻醉后使用5 mg/kg LPS 進行氣管滴注，正常組使用生理鹽水氣管滴注。藜蘆醇干預組采用羥丙基β-環糊精包合后以生理鹽水溶解，在模型復制前4 天早晚使用30 mg/kg 劑量腹腔給藥。Cav-1 過表達的ALI 組在小鼠模型復制前1個月使用尾靜脈注射GV287-Cav-1 過表達載體5×108pfu/鼠，再使用5 mg/kg LPS 進行氣管滴注模型復制。Cav-1 過表達的ALI+白藜蘆醇干預組在模型復制前1個月尾靜脈注射GV287-Cav-1 過表達載體5×108pfu/鼠，模型復制前4 天早晚用30 mg/kg 的白藜蘆醇腹腔注射，再使用5 mg/kg LPS 進行氣管滴注模型復制。本研究經醫院動物倫理委員會批準，并嚴格遵守倫理原則。

1.3 酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測血清TNF-α、IL-6 水平

模型復制后24 h 采用摘眼球處死法留取小鼠血清，3 000 r/min 離心10 min，取上層血清。參照試劑盒說明書操作檢測血清TNF-α、IL-6 水平。

1.4 免疫組織化學染色觀察Cav-1 小鼠在肺組織中的表達和分布

模型復制后24 h 處死小鼠，取肺臟組織用于免疫組織化學檢測肺臟Cav-1。肺組織標本石蠟切片、脫蠟至水、阻斷內源性過氧化物酶、抗原修復、加抗體后二氨基聯苯胺法（DAB）顯色。觀察肺組織標本中彌漫性肺間質及肺泡水腫、肺泡上皮及肺組織內血管內皮細胞損傷等ALI 特征性病理改變，觀察Cav-1 小鼠在肺組織中的表達和分布情況。

1.5 Western blotting 檢測Cav-1 在肺組織中的表達

冰浴條件下取肺組織200 mg 通過細胞裂解液裂解，13 000 r/min 低溫離心5 min 后取上清液，采用BCA 法檢測蛋白含量，取50 μg 上樣量用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離，400 mA 1.5 h轉至聚偏二氟乙烯膜（PVDF），用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉2 h，Cav-1 抗體（1 ∶1 000）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（1 ∶1 000）4℃孵育過夜。次日TBST（Tris-HCl 緩沖鹽溶液+吐溫）洗滌后，用辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（1 ∶1 000）孵育2 h 后電化學發光（ECL）法顯影。

1.6 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠Cav-1 的表達

各組小鼠Cav-1 的表達水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=13.227，P=0.023）。與正常組小鼠Cav-1 表達水平（0.086±0.017）比較，ALI 組小鼠Cav-1 表達水平（0.214±0.018）升高（P＜0.05），ALI+白藜蘆醇干預組小鼠的Cav-1 表達水平（0.180± 0.022）較ALI 組降低（P＜0.05）。Cav-1 過表達的ALI 組中的Cav-1 表達水平（0.399±0.039）比ALI 組和ALI+白藜蘆醇干預組升高，而Cav-1 過表達的ALI+白藜蘆醇干預組的Cav-1 表達水平（0.264±0.034）較Cav-1 過表達的ALI 組降低（P＜0.05）。見圖1。

2.2 過表達Cav-1 對小鼠肺組織病理的影響及白藜蘆醇的抑制作用

正常組小鼠肺組織結構正常，Cav-1 定位在平滑肌細胞、肺泡細胞和血管內皮細胞的細胞膜；ALI 組小鼠肺部出現水腫，肺泡間隔增寬，形態破壞，Cav-1的表達強于正常組（P＜0.05）；而經白藜蘆醇處理后的ALI+白藜蘆醇干預組小鼠肺水腫較ALI 組小鼠減輕，肺泡形態較ALI 組小鼠有所好轉，Cav-1 表達較ALI 組有所降低（P＜0.05）；Cav-1 過表達的ALI 組小鼠肺水腫更加明顯，Cav-1 表達呈強陽性；Cav-1過表達的ALI+白藜蘆醇干預組小鼠中Cav-1 表達則較Cav-1 過表達的ALI 組降低。見圖2。

2.3 過表達Cav-1 對TNF-α、IL-6 的影響以及白藜蘆醇的作用

各組小鼠血清TNF-α、IL-6 表達比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與正常組比較，ALI 組小鼠血清TNF-α、IL-6 表達升高（P＜0.05）；而ALI+白藜蘆醇組小鼠血清TNF-α、IL-6 表達則較ALI 組降低（P＜0.05）。同時Cav-1 過表達的ALI 組小鼠血清TNF-α、IL-6 表達較ALI 組升高（P＜0.05）；而Cav-1過表達的ALI 組+白藜蘆醇組小鼠血清TNF-α、IL-6的濃度比Cav-1過表達的ALI組降低（P＜0.05）。見表1。

圖1 各組小鼠肺組織中Cav-1 的表達

圖2 各組小鼠肺組織病理及Cav-1 定位 （×400）

表1 各組小鼠血清中TNF-α 和IL-6 表達比較 （n =10，pg/ml）

3 討論

ALI 是臨床常見危重癥，通常由感染、創傷、休克等因素誘發。疾病早期是以彌漫性肺泡損傷、肺泡上皮細胞屏障功能破壞受損，激活肺內多種炎癥細胞，啟動細胞內信號傳導系統，引起炎癥因子的級聯反應，導致失控性炎癥反應的發生[1]。因此控制原發疾病和遏制炎癥反應是防治ALI 的一種有效策略和方法。

Cav-1 是一個分子量為21～25 kD 的膜蛋白，是膜小窩的結構性蛋白，廣泛存在于肺泡上皮細胞，血管內皮細胞、纖維細胞的細胞膜表面。長期以來，有關Cav-1 的研究主要集中在腫瘤轉移、物質轉運、信號傳導等方面，在ALI/急性呼吸窘迫綜合征發病中的研究較為少見。有研究顯示，Cav-1 參與絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）、細胞外調節蛋白激酶（ERK）、核轉錄因子-κB（NF-κB）等信號轉導通路的磷酸 化[2-3]，而該信號通路影響著ALI 發病過程中炎癥反應的瀑布效應，因此，筆者推測Cav-1 在ALI 發病機制的炎癥反應中起重要作用。研究發現[4]，和LPS 誘導的ALI 野生型小鼠比較，Cav-1 基因敲除小鼠可通過內皮型一氧化氮合成酶（eNOs）途徑抑制NF-κB 的活性，減少炎癥細胞因子的合成與分泌。然而另有學者發現，在巨噬細胞中Cav-1 能與Toll 樣受體4（toll-like receptor 4, TLR4）相互作用并經血紅素氧化酶-1 途徑抑制TLR4 相關信號傳導而減輕ALI 病變程度[5-6]。該研究發現，高表達的Cav-1 能在LPS 的誘導下分泌更多的炎癥因子，加重肺部炎癥損傷。

目前，隨著炎癥機制深入研究，中藥及其有效成分的抗炎效果引起越來越多研究者的注意，其安全可靠、物美價廉，成為繼非甾體類抗炎藥和腎上腺皮質激素類抗炎藥后又一類廣泛應用的抗炎中藥[7]。白藜蘆醇，一種多酚類化合物，存在于多種中藥如虎杖、藜蘆中，目前已證實具有清除自由基、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、調節免疫等作用[8]。有研究表明，白藜蘆醇能降低細胞中TLR4 的表達和抑制PI3K 和NF-κB 的磷酸化。本研究中，白藜蘆醇干預后能抑制ALI 小鼠中TNF-α 和IL-6 的表達水平，在高表達Cav-1 的小鼠ALI 中，白藜蘆醇同樣能下調小鼠中炎癥因子TNF-α和IL-6 的表達，減輕肺組織炎癥反應，其機制與降低Cav-1 的表達密切相關。為臨床早期防治ALI 提供新思路和新選擇。