氣相色譜-質譜聯(lián)用技術對小鼠急性肝損傷的代謝物及相關代謝通路的研究*

馬小芬，蘇比努爾·巴克，李珍，李德龍，馬曉麗

（新疆醫(yī)科大學 藥學院，新疆 烏魯木齊 830011）

急性肝損傷是引起肝硬化、肝癌的重要因素[1]，四氯化碳CCl4誘導的肝損傷是經典的肝損傷模型之一[2-5],其損傷肝細胞的主要機制是通過強氧化性自由基及脂質過氧化物的產生，造成肝臟組織損傷[6]。如何從代謝組學角度研究CCl4導致急性肝損傷的作用機制，發(fā)現(xiàn)致毒標志物將有助于對這一經典肝毒性物質的中毒機制的認識。

目前，基于高分辨核磁共振[7]（nuclear magnetic resonance, NMR）、氣相色譜-質譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS）[8]、液相色譜-質譜聯(lián)用（liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS）等[9]代謝組學分析技術被廣泛地應用于標志物的篩查和分析[10]及疾病診斷、毒理學研究、新藥研發(fā)與藥物篩選等[11]，其中GC-MS 被認為是分析組織代謝產物的標準技術之一[12]。本文應用GC-MS代謝組學技術探尋CCl4致小鼠急性肝損傷的肝組織代謝標志物；運用Metabo Analyst 3.0 在線代謝組分析工具進行基于偏最小二乘判別分析（partial least squares-discrimination analysis, PLS-DA）的代謝物查找及代謝通路分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器GC-MS聯(lián)用儀（GC：waters, MS：Agilent 7683B series）、可視氮吹儀、KQ-500DE 型超聲儀（昆山超聲儀器有限公司），HH-S4恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠），低溫離心機（美國Thermo Fisher Scientific 公司），HV-3 靜音無油空壓機（濟南浩偉實驗儀器有限公司）。

1.1.2 試劑 甲氧胺鹽酸鹽、N-甲基-（三甲基硅烷基）-三氟乙酰胺（MSTFA）、三甲基一氯硅烷（TMCS）、分析純、十七烷酸（美國Sigma 公司），甲醇、乙腈（美國Fisher chemicals 公司），色譜純、吡啶（天津大茂化學試劑廠，生產批號：20150612），分析純、實驗用水取自新疆醫(yī)科大學超純水。

1.2 實驗動物及分組

SPF 級雄性昆明種小鼠，體重（20.0±2.0）g，由新疆醫(yī)科大學動物中心提供，所有動物飼養(yǎng)按照國家動物實驗規(guī)定執(zhí)行。將適宜喂養(yǎng)的22 只小鼠隨機分為對照組和模型組，每組11 只。對照組和模型組小鼠適應性灌胃生理鹽水0.5 ml 3 d 后，模型組腹腔注射0.1% CCl4橄欖油溶液10 ml/kg，對照組腹腔注射生理鹽水橄欖油溶液10 ml/kg。小鼠于模型復制后禁食不禁水12 h，立即斷頸處死，快速取出 完整肝臟，生理鹽水洗盡殘血，除去結締組織，濾紙拭干，稱重；準確稱取0.50 g 肝臟，按1 ∶9（g ∶ml）加入冰生理鹽水，冰浴下手動勻漿，4 000 r/min 離心5 min，分離得到10%肝勻漿上清液，置入-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 肝組織病理切片

取小鼠左葉相同位置肝組織，用4℃生理鹽水沖盡殘血，濾紙拭干，10%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色，光學顯微鏡下觀察肝組織切片的病理形態(tài)學變化。

1.4 GC-MS 代謝組學分析

1.4.1 樣品前處理 參考文獻[13-14]將置于-80℃冷凍保存的樣品復溶后取100 μl 置于2 ml EP 管內，加入250 μl 乙腈溶液混勻，渦旋1.5 min，冰浴超聲10 min，4℃、10 000 r/min 離心10 min 后，取上清液置于2 ml EP 管內用氮吹干。加15 g/L 甲氧胺吡啶溶液50 μl 混勻，70℃下肟化1 h 后加入衍生化試劑（MSTFA ∶TMCS=100 ∶1）50 μl 混勻，靜止。1 h后加含十七烷酸的乙腈溶液（0.9 mg/ml）150 μl 混勻，4℃、10 000 r/min 離心10 min，取上清液于內插管內置于微量進樣瓶待測。

1.4.2 GC-MS 條件 升溫程序為：85℃保持5 min后，以10℃/min 上升至300℃，保持10 min；進樣量：2 μl，不分流進樣；進樣口溫度：270℃；接口溫度：270℃；離子源溫度：230℃；電離電壓：70 eV；四極桿溫度：150℃；載氣：高純氦氣，1.0 ml/min；掃描方式：全掃描60～600 m/z。每次進樣時均用甲醇和乙腈清洗進樣針各4 次，避免前一次樣品影響結果。

1.4.3 GC-MS 圖譜數據處理 GC-MS 的總粒子流圖（TIC）中共有的峰和具有代表性的峰被提取出來，并對所有的峰進行手動峰面積積分，獲取各個峰與內標峰的保留時間及峰面積導入Excel 表內備用，用樣品峰面積與內標峰的比值（相對峰面積）表示代謝物的含量。

1.5 統(tǒng)計學方法

數據分析采用SPSS 17.0 和Metabo Analyst 3.0 統(tǒng)計軟件，對歸一化后峰面積相對值導入SIMCA-P12.0統(tǒng)計軟件進行PLS-DA 分析[15]，最大化地顯示出組間的差異。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。使用PLS-DA 模型中變量重要性投影（variable importance in the projection, VIP）和兩獨立樣本t檢驗來共同評價可能的內源性代謝物相對峰面積的差異，只有同時滿足VIP＞1 和P＜0.05 的代謝物才被認為是潛在生物學標志物[16-17]。

2 結果

2.1 CCl4 急性肝損傷模型病理變化

對照組小鼠肝組織病理切片與模型組比較，模型組小鼠的肝細胞排列紊亂，部分肝細胞內見大小不等的脂滴空泡，另有部分區(qū)域小葉內肝細胞點狀、灶狀滑絲，伴有碎片狀肝細胞浸潤，肝中央靜脈及肝血竇充血，壞死灶區(qū)有較多淋巴細胞浸潤。見圖1。

2.2 GC-MS 結果

2.2.1 NIST 圖譜中各代謝物圖譜 通過XCMS Online 軟件進行肝組織樣品數據采集，得到各組典型TIC，通過TIC 中提取的峰面積一一在NIST 譜庫中進行對比找到33 種共有代謝物質，通過參照文獻[18]進行查詢比對出14 種可能的內源性代謝物。見圖2。

2.2.2 PLS-DA 結果 歸一化后峰面積相對值的PLS-DA 分析結果見圖3，可看出模型組各小鼠間比較分散，這可能是模型復制后個體差異造成的。3D圖中對照組與模型組兩組間有差異，且具有明顯的聚類特征。表明小鼠肝組織的生理環(huán)境及物質代謝發(fā)生變化可能是CCl4致肝損傷[19]。

圖1 CCl4 誘導的急性肝損傷小鼠肝組織的組織病理學觀察 （HE×400）

圖2 GC-MS 各代謝物質譜圖譜

2.2.3 差異性代謝物及潛在生物學標志物 根據對照組和模型組內源性代謝物相對峰面積的差異，分析發(fā)現(xiàn)5 種可能的差異性代謝物（P＜0.05），包括葡萄糖醛酰胺、D-酪氨酸、腺嘌呤、D-葡萄糖和麥角固醇。由表中的VIP＞1 同時結合t檢驗結果可以說明這5種代謝差異物是CCl4肝損傷的可能潛在代謝標志物。見表1。

2.2.4 通路分析 將10個通過模式識別篩選出的差異代謝物導入Metabo Analyst 3.0 網站進行代謝通路分析。可知CCl4模型復制后主要對機體的甲硫氨酸代謝、苯丙氨酸代謝、嘌呤代謝等代謝通路產生影響。見 圖4。

圖3 兩組小鼠肝組織樣品3D PLS-DA 得分圖

表1 與CCl4 誘導的小鼠急性肝損傷相關的差異代謝物

圖4 兩組差異代謝物引起的代謝通路變化

3 討論

本研究采用GC-MS 技術對CCl4所致急性肝損傷小鼠進行肝組織的代謝組學研究。采用PLS-DA 等多元分析模式識別方法及傳統(tǒng)的SPSS 17.0 統(tǒng)計進行分析，共篩選出5個生物標志物，分別是葡萄糖醛酰胺、D-酪氨酸、腺嘌呤、D-葡萄糖、麥角固醇。經Metabo Analyst 3.0 數據分析，CCl4所致急性肝損傷小鼠主要對機體的甲硫氨酸代謝、苯丙氨酸代謝、嘌呤代謝等代謝通路產生影響。

CCl4是一種經典的肝毒藥物，從代謝組學角度找出一些具有特異性變化規(guī)律的代謝物，全面揭示其生物效應。小鼠經CCl4模型復制后，肝組織切片表明其肝細胞明顯壞死，表明小鼠肝組織的生理環(huán)境及物質代謝發(fā)生變化可能是CCl4致肝損傷[19]。對肝臟組織中的代謝物查找發(fā)現(xiàn)其肝臟組織損傷主要表現(xiàn)在能量供給阻礙，以及氨基酸代謝紊亂，小鼠肝細胞循環(huán)受到抑制，并且由于脂蛋白合成受阻,是脂肪酸從肝臟到血漿的分泌和轉運機能明顯下降。特別是肝組織中酪氨酸物質含量下降，這種結果很可能是由于氨基酸在肝臟的轉運受到阻礙，因此其相互轉化受阻，其直接的表現(xiàn)為參與機體能量代謝的相關通路和循環(huán)比如苯丙氨酸代謝通路及三羧酸循環(huán)受到抑制，進而引發(fā)一系列的級聯(lián)反應，最終表現(xiàn)出肝衰竭的相應 表征。

苯丙酸屬于芳香族氨基酸是苯丙酮酸和酪氨酸的主要合成原料，均在苯丙氨酸代謝通路中有著重要作用，機體內酪氨酸的含量會引起某些代謝中間產物的變化而導致肝功能損傷或腎小管缺陷。甲硫氨酸是含硫必需氨基酸，機體內甲硫氨酸不足會使細胞內蛋白質的合成受到影響，進而引起肝功能障礙。YADAK等[20]研究發(fā)現(xiàn)嘌呤脫氧核苷可導致肝臟發(fā)生毒性，嘌呤脫氧核苷在機體內的變化最終體現(xiàn)在嘌呤代謝通路中。本研究中小鼠肝組織酪氨酸物質含量下降及嘌呤代謝物變化可能與代謝通路間密切相關，但具體影響急性肝損傷嘌呤代謝通路的物質并不清楚，有待進一步深入研究。

本研究成功地將代謝組學分析方法引入急性肝損傷的研究中，并通過在線數據庫分析影響肝臟病理變化的相關代謝通路，為深入探討急性肝損傷模型的作用機制奠定了一定的實驗基礎。