治療前后RA患者血清炎癥因子水平及單個核細胞、滑膜成纖維細胞炎癥因子基因表達觀察

鎖星星，婁方明，裘影影，芮金兵，王燕茹，湯郁

江蘇大學附屬醫院，江蘇鎮江 212000

類風濕性關節炎(RA)是一種慢性炎癥性自身免疫疾病，其特征在于慢性炎癥和進行性關節破壞。滑膜內膜的滑膜成纖維細胞(SFs)在滑膜炎癥的發生發展以及與RA相關的關節破壞中起關鍵作用[1]。活化的RA FLS顯現出促炎因子和趨化因子的遷移、侵襲和分泌的異常[2,3]。經典的理論認為，細胞免疫異常是滑膜細胞增生的主要機制，T淋巴細胞、巨噬細胞、成纖維細胞的活躍導致大量炎癥因子的浸潤，其中包括白細胞介素6(IL-6)、IL-1、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等[4]。IL-8也參與了RA的病理過程，在滑膜組織炎癥中起重要作用[5]。IL-6、IL-8、TNF-α在RA疾病發生發展中有重要作用。本研究觀察了RA患者血清、單個核細胞、SFs中IL-6、IL-8、TNF-α水平變化，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年7月～2018年7月江蘇大學附屬醫院收治的RA患者40例，男6例、女34例，年齡21～74歲，病程2～47 a，使用托珠單抗(IL-6抑制劑)治療20例、強克(TNF-α抑制劑)治療20例；以20例健康體檢者作對照，排除類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡等疾病。選取同時段在江蘇大學附屬醫院行膝關節置換手術的RA和OA患者各5例，OA患者男2例、女3例，年齡40～79歲，病程21～47 a；RA患者男2例、女3例，年齡51～75歲，病程28～39年；近期均未使用藥物治療，排除感染和其他炎癥性疾病，手術中獲取膝關節滑膜組織，消化滑膜組織標本，并培養SFs。

1.2 血清TNF-α、IL-6、IL-8檢測方法

1.2.1 RA患者與健康者血清IL-6、IL-8、TNF-α檢測方法 取RA患者(未使用托珠單抗及強克治療前)和健康者外周血，以2 500 r/min速度離心5 min，獲得血清，采用ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-6、IL-8的表達。具體方法：首先，按照Human ELISA KiT試劑盒說明制備好溶液，稀釋標準品和樣本，然后設置空白孔、標準孔、待測樣品孔，加樣，用膜覆蓋孔板，放入37 ℃的孵箱中孵育90 min，洗板4次，加入生物素化抗體工作液，封板，37 ℃的孵箱中孵育60 min，洗板4次，加入酶結合物工作液，封板，37 ℃的孵箱中孵育30 min，洗板4次，加入顯色劑100 μL/孔，避光，37 ℃的孵箱中孵育20 min，加入終止液100 μL/孔，混勻后酶標儀即刻測量OD450值，利用軟件Curve Expert1.3通過標準品的不同濃度相對應的OD值作出標準曲線圖，然后通過每個樣本對應的OD值計算每個樣本所對應的濃度，然后乘以稀釋倍數得到樣本終濃度。

1.2.2 RA患者IL-6、TNF-α抑制劑治療前后血清IL-6、IL-8、TNF-α檢測方法 取20例使用托珠單抗(IL-6抑制劑)、20例使用強克(TNF-α抑制劑)治療前后RA患者外周血，分離血清，采用ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-6、IL-8的表達，具體方法同上。

1.3 SFs和單個核細胞IL-6、IL-8、TNF-α檢測方法

1.3.1 SFs IL-6、IL-8、TNF-α檢測方法 取行膝關節置換手術的RA和OA患者各5例，均未使用藥物治療，排除感染和其他炎癥性疾病，手術中獲取膝關節滑膜組織，消化滑膜組織標本，并培養SFs。SFs的培養：取膝關節患者滑膜組織，加入適量的一型膠原酶消化液，將其剪至約2 mm×2 mm×2 mm，移至培養瓶中，避光，5%CO2、37 ℃培養箱消化4 h，經濾網過濾組織塊后于1 200 r/min離心5 min后棄上清，加入適量20%FBS培養液吹打混勻，移至培養瓶中，37 ℃培養箱培養48 h，每3～4 d更換培養液，當細胞生長至覆蓋底部70%～80%傳代，待細胞長至第三代進行qRT-PCR實驗，具體方法同上。

1.3.2 單個核細胞IL-6、IL-8、TNF-α檢測方法 取20例使用托珠單抗(IL-6抑制劑)、20例使用強克(TNF-α抑制劑)治療前后RA患者外周血。首先，制備單個核細胞，靜脈取RA患者外周血至肝素抗凝管中，加入1.5倍PBS，稀釋血細胞打勻，再將打勻血加在已放1.5倍的淋巴細胞分離液中，保證血在上層，以2 500 r/min速度離心20 min，后取中間絮狀物，將中間絮狀物加入另外玻璃試管內，加1.5倍PBS混勻，以2 500 r/min速度離心20 min，棄液取沉淀，后再加1.5倍PBS混勻，2 500 r/min速度離心離心20 min，棄液取沉淀，加1 mL的PBS打勻后轉至1.5 mL小離心管中，12 g，離心5 min，棄液取沉淀即為單個核細胞，進行qRT-PCR試驗。具體方法：用Trizol法提取細胞總RNA，采用Oligo(dt)引物利用反轉錄酶反轉錄成cDNA(逆轉錄過程按TaKaRa逆轉錄試劑盒進行，總反應體系20 μL)，再以cDNA為模板進行PCR擴增檢測基因表達(PCR擴增過程按TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq試劑盒進行，總反應體系20 μL)。熒光定量PCR引物由上海捷瑞有限公司合成，IL-6：CCTCCAGAACAGATTTGAGAGTAGT，GGGTCAGGGGTGGTTATTGC；IL-8：GACATACTCCAAACCTTTCCACCC，TTCAAAAACTTCTCCACAACCCTC；TNF-α：AGGACACCATGAGCACTGAAAGC，AAGGAGAAGAGGCTGAGGAACAAG；β-actin：GTCATAGTCCGCCTAGAAGCA，GATCATTGCTCCT CCTGAGC。反應結束后得到CT值，以目的基因的CT值減去內參β-actin的CT值計算出ΔCT，以2-ΔΔCT計算目的基因的mRNA相對表達量。

1.4 IL-8 si-RNA轉染的RASFs滑膜成纖維細胞IL-6、IL-8、TNF-α檢測方法 取行膝關節置換手術的RA患者5例，未使用藥物治療，手術中獲取膝關節滑膜組織，分離培養RASFs，具體方法同“1.3.2”。由于現無IL-8抑制劑用于臨床，故使用針對IL-8的si-RNA(蘇州吉瑪基因設計)轉染RASFs，沉默IL-8基因。siRNA的正義鏈：5′-GAAGAGGGCUGAGAAUUCATT3′ 5′-UGAAUUCUCAGCCCUCUUCTT3′。首先，將培養至第三代的RASFs細胞接種于六孔板中，調整待細胞溶度為5×105，細胞融合至70%～80%，換無血清的培養液，饑餓細胞2 h，然后將siRNA和lip2000成比例混合加入六孔板中，5%CO2、37 ℃培養箱孵育12 h，換成20%FBS培養液，培養72 h后，收集細胞，ELISA檢測細胞上清液中IL-6、IL-8、TNF-α，方法同“1.2.1”，qRT-PCR檢測細胞IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA的表達，方法同“1.3”。

2 結果

2.1 RA患者血清IL-6、IL-8、TNF-α水平比較 RA患者與健康者血清IL-6、IL-8、TNF-α水平比較見表1，RA患者TNF-α抑制劑治療前后血清IL-6、IL-8、TNF-α比較見表2，RA患者IL-6抑制劑治療前后血清IL-6、IL-8、TNF-α比較見表3。

2.2 SFs和單個核細胞IL-6、IL-8、TNF-α表達比較 RA、OA患者SFs IL-6、IL-8、TNF-α表達比較見表4，RA患者TNF-α抑制劑治療前后單個核細胞IL-6、IL-8、TNF-α比較見表5，RA患者IL-6抑制劑治療前后單個核細胞IL-6、IL-8、TNF-α比較見表6。

2.3 IL-8 si-RNA轉染的RASFs IL-6、IL-8、TNF-α水平變化 結果見表7。

表1 RA患者與健康者相比IL-6、ILTNF-α水平比較

注：與健康對照組相比，*P<0.05。

表2 RA患者TNF-α抑制劑治療前后血清IL-6、IL-8、TNF-α比較

注：與治療前比較，*P<0.05。

表3 RA患者IL-6抑制劑治療前后血清IL-6、IL-8、TNF-α比較

注：與治療前比較，*P<0.05。

表4 RA和OA患者SFs IL-6、IL-8、TNF-α表達比較

注：與OA患者比較，*P<0.05。

表5 RA患者TNF-α抑制劑治療前后單個核細胞IL-6、IL-8、TNF-α比較

注：與治療前比較，*P<0.05。

表6 RA患者IL-6抑制劑治療前后單個核細胞IL-6、IL-8、TNF-α比較

注：與治療前比較，*P<0.05。

表7 IL-8 si-RNA轉染的RASFs IL-6、IL-8、TNF-α水平變化

注：與NC對照比較，*P<0.05。

3 討論

RA是一種慢性炎性自身免疫性疾病，具有很高的發病率和致殘性，其通過臨床破壞關節軟骨和骨骼，損害多個器官的進程和生活質量[6]，主要臨床表現為晨僵、關節腫痛、關節畸形，類風濕結節和血管炎。RA的主要病理特征是滑膜炎癥、滑膜組織增生和骨軟骨破壞，滑膜增生和持續性滑膜炎癥與炎性免疫細胞浸潤滑膜細胞中是RA的標志[7]。成纖維細胞樣滑膜細胞在RA的病理生理過程中起著重要作用，細胞因子的分泌異常在RA發病中也起著重要作用。

免疫性疾病的細胞因子存在相互影響，他們相互作用形成一個免疫網絡[8]。TNF-α、IL-6、IL-18等細胞因子都直接或間接地參與了RA的免疫反應、和免疫損傷[9,10]。TNF-α在RA發病的機制已有多項報道。一項針對北印度人口的研究顯示，RA患者的循環TNF-α水平、mRNA表達呈正相關，比健康人群高4.5倍[11]。Moelants等[12]發現，RA患者的血清和關節炎滑膜中大量存在TNF-α。還有研究顯示，RA患者外周血TNF-α含量高于正常人，TNF-α通過抑制α1(I)膠原啟動子的激活以及增強MH7A(滑膜成纖維細胞系)細胞中VEGF和IL-6的分泌而參與RA[13]。不僅如此，抗TNF-α治療對RA過程中的細胞外基質重塑具有有益作用[14]。IL-6是一種細胞因子，涉及與RA相關的炎癥的許多方面，包括急性期反應、B細胞分化、抗體產生、T細胞增殖、內皮細胞活化、核因子κB配體受體因子(RANKL)表達和骨痂活化[15,16]。有研究表明，RA患者血漿和關節液中IL-6和IL-8水平也發現顯著升高，并且與RA病變的活動性呈正相關[17]。且來自RA和OA患者SFs被發現是主要的IL-6產生者[18]。也有報道顯示，RA患者的滑液和血清中可檢測到IL-8[19,20]，IL-8參與了RA關節的疼痛[21]。本研究顯示，RA患者血清及滑膜成纖維細胞中IL-6、IL-8、TNF-α水平及mRNA表達高于正常人，證實IL-6、IL-8、TNF-α在RA發病中的作用。Huang等[22]發現，在HK-2(人近端腎小管細胞)中TNF-α可增加IL-6和IL-8的產生，并且這些作用被10 nM的VIP(血管活性腸肽)增強。Namba等[23]發現，在犬滑膜成纖維細胞中TNF-α可以誘導IL8的表達和分泌。有研究[24]表明TNF-α可誘導RA成纖維樣滑膜細胞IL-6、IL-8的表達。Zhang等[25]發現，RA中成纖維樣滑膜細胞使用TNF-α處理后，IL-2、IL-6、IL-8的表達隨時間逐漸增加，但它們的mRNA水平在48 h時顯著下降。本研究顯示，使用TNF-α抑制劑治療的RA患者血清中IL-6、IL-8水平均較治療前降低，而使用IL-6抑制劑治療的患者血清TNF-α變化不明顯，提示TNF-α可能在三者的網絡中處于較為上游的位置，抑制其表達可同時對其余二者的表達起到影響。有關IL-6與IL-8相互影響的研究不多。僅有的研究顯示IL-6增強了信號轉導子和轉錄激活因子3(STAT3)的激活以及RA中性粒細胞向IL-8的遷移[26]。本研究RA患者使用IL-6抑制劑后血清IL-8有下降的趨勢，但未見統計學差異。而干擾滑膜成纖維細胞的IL-8基因后對IL-6的mRNA和蛋白表達影響不大，但可抑制TNF-α的mRNA和蛋白表達。提示在RA的炎癥網絡中IL-6可影響IL-8的表達，而TNF-α和IL-8可以相互影響。

總之，RA患者IL-6、IL-8、TNF-α水平高于健康者及OA患者；TNF-α抑制劑使IL-6、IL-8、TNF-α降低，IL-6抑制劑使IL-6、IL-8表達降低，IL-8 si-RNA使IL-8、TNF-α表達水平降低。