免疫療法在骨肉瘤治療中應用的研究進展

李森，尹靜，林碧蓉，謝明忠，李茜，古欽文，戚力升，彭道琥，朱凱

1 西南醫科大學附屬中醫醫院，四川瀘州 646699；2重慶市北碚區中醫院

骨肉瘤是最常見的原發性骨惡性腫瘤，主要發生在兒童和青少年中[1]，是由產生未成熟骨或類骨質組織的惡性成骨細胞組成[2]。目前新輔助化療(化療3～4次后再手術切除)加化療的方案治愈了約70%的患者，但高級別的變異性骨肉瘤及繼發性骨肉瘤對于化療并不敏感，總體預后較差，總體5年生存率僅約為20%[3]。近年來，隨著對機體免疫系統探究的逐漸深入，免疫療法非常有希望成為繼手術、化療之后能夠有效治療惡性骨肉瘤的綜合治療手段之一[4]。2013年《科學》雜志將腫瘤免疫療法列為年度十大科學突破之首，腫瘤免疫療法成為全球研發的熱點。免疫系統主要包括固有免疫系統和適應性免疫系統，固有免疫細胞中的巨噬細胞和肥大細胞通過釋放細胞因子與其他免疫細胞相互作用來啟動炎癥反應，樹突狀細胞(DCs)通過結合外來抗原并呈遞給適應性免疫細胞來進行識別。適應性免疫細胞由B淋巴細胞、CD4+T輔助淋巴細胞(CD4+Th)和CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CD8+T)組成[5]。在腫瘤微環境(TME)中，具有溶骨潛能的骨肉瘤細胞[6]產生的PTHrP、TGF-β、IL-6和IL11等因子，刺激破骨細胞的過度活化，促進了骨基質中的生長因子分泌，其它免疫細胞通過細胞因子和激酶介導的信號通路促進骨肉瘤的增殖和轉移，在有利于血管生成、干性和轉移的環境下，骨肉瘤細胞分泌的細胞因子又進一步促進骨襯細胞的激活，最終形成了TME中包含骨肉瘤細胞在內的多種類型細胞共同參與的“惡性循環”[7]。腫瘤細胞、免疫細胞和基質細胞之間的相互作用使TME產生了不同的功能分區，即含有以CD4+Th和CD8+T為主的腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)的免疫浸潤區、完全沒有TIL的免疫缺失區和處于中間狀態的免疫排斥區[8]。有效的癌癥免疫療法需要TME中TILs的大量激活以及腫瘤相關抗原的免疫識別和有效的細胞毒性功能。因此，研究者針對不同的免疫缺失的原因采用了不同的免疫療法策略，包括細胞因子、腫瘤疫苗(或多肽疫苗)、免疫細胞和免疫檢查點抑制劑等方法。現就免疫療法在骨肉瘤治療中的應用研究進展情況作一綜述。

1 細胞因子的應用

細胞因子是由免疫細胞和非免疫細胞合成、分泌的小分子多肽物質，包括白細胞介素(IL)、干擾素(IFNs)、集落刺激因子(CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)和趨化因子家族等。目前，多種細胞因子已被用于惡性腫瘤患者的免疫療法，通過促進免疫細胞的增殖和分化，增強抗感染和殺腫瘤細胞效應，發揮免疫調節作用。IFN-α具有誘導分化、凋亡、抑制增殖和血管生成的作用，在骨肉瘤等多種惡性腫瘤中有臨床療效[9]。在一項用化療藥物(阿霉素、順鉑和甲氨蝶呤，MAP)聯合或不聯合IFN-α治療骨肉瘤的臨床試驗中，雖然短時間內觀察到IFN-α-2b僅起到較小的輔助性作用，但隨訪仍然繼續以確定長期生存率[10]。IL-2誘導淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)活化，識別和清除多種腫瘤細胞[11]，現在僅在腎細胞癌和黑色素瘤的臨床試驗觀察到IL-2的療效[12]。關于IL-2治療骨肉瘤的臨床試驗報道較少，一項小規模人群試驗發現高劑量的IL-2可以誘導部分轉移性骨肉瘤患者的完全反應，但也出現了嚴重的毒性反應[13]，這也是系統使用強效細胞因子的普遍問題，目前研究尚未觀察到IFN-α和IL-2的直接活化顯著改善骨肉瘤預后的現象。粒細胞—巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)雖然能夠誘導人骨肉瘤細胞在體外分化和凋亡，臨床試驗顯示這些因子與骨肉瘤的預后改善或免疫調節作用無關[14]。

2 腫瘤疫苗(或多肽疫苗)的應用

腫瘤疫苗屬于特異性免疫療法，主要包括滅活的自體腫瘤細胞、提取的腫瘤抗原、人工合成的腫瘤抗原肽、病毒抗原、DNA疫苗或抗原呈遞細胞(APC)疫苗等，通過激發機體的抗腫瘤免疫反應進行作用，如靶向腫瘤裂解物、蛋白和多肽的疫苗等[15]。實際上，在骨肉瘤中利用細菌感染或接種疫苗刺激抗腫瘤免疫反應的研究已有100多年的歷史，1891年外科醫生威廉·科利使用了高溫滅活的化膿性鏈球菌和馬耳森沙雷菌的混合物(科利毒素)誘發丹毒，刺激免疫反應，使大約10%的骨組織和軟組織肉瘤患者中達到完全緩解[16]。有研究[17]顯示，發生術后感染的骨肉瘤患者的生存率明顯高于未發生感染的患者，表明細菌具有激活抗腫瘤免疫反應的能力。最近，一項研究顯示接受卡介苗(BCG)和腫瘤疫苗治療的17例患者中，有3例(18%)無病生存，而12例未經治療的患者中則為0例[18]?？评舅睾虰CG誘發系統性的多種促炎細胞因子IL-6、TNF-α和IFN-γ等的表達，引起急性細胞毒性免疫細胞活化和腫瘤消退[19]。通常用于治療骨肉瘤的化療藥物MAP也是通過殺死Treg和MDSCs并激活免疫效應細胞誘發了免疫抗腫瘤活性，免疫佐劑胞壁酰二肽(米法莫肽)是細菌細胞壁成分細菌肽聚糖的合成類似物，是非特異性免疫調節劑，通過激活固有免疫系統，提高血清中TNF-α和IL-6的水平，從而殺死腫瘤[20]。在轉移性骨肉瘤患者中，在化療中添加米法莫肽也趨向于改善無事件性和總體生存率，但無統計學意義[21]。這些結果表明，細菌組分在骨肉瘤患者治療和復發的風險降低，可以考慮用細菌疫苗和滅活的腫瘤細胞誘導抗腫瘤免疫反應。

腫瘤疫苗應用于骨肉瘤治療的主要障礙是其特異性抗原一直難以識別，多數在骨肉瘤上表達的抗原，在正常組織中也表達[22]。近年來，通過抗原呈遞細胞如DC增強晚期肉瘤特異性免疫反應得到了發展[23]，DC經腫瘤裂解物致敏后可以顯著增加CTLs活性，誘導血清IFN-γ水平的升高、肺轉移減少及轉移區域CD8+T淋巴細胞增多[24]。另外，通過聯合抗細胞毒性T淋巴細胞抗原-4(CTLA-4)抗體和抗糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體(GITR)的抗體增強了全身免疫反應[25]。在多數基于DC的免疫療法的臨床研究中，未見嚴重不良反應的報道，但也顯示只有少量患者的臨床結果有所改善[26]。迄今為止，使用自體DC或骨肉瘤特異性抗原的疫苗接種策略仍局限于臨床前或早期臨床研究，因此需要進一步研究明確骨肉瘤相關特異抗原及其適應證，改善骨肉瘤的細胞免疫療法。

3 免疫細胞的應用

免疫細胞治療是通過將自體或異體免疫細胞在體外給予不同細胞因子的刺激進行擴增，而后回輸入患者體內，發揮調動機體免疫功能、發揮殺滅腫瘤的作用。分為兩類，第一類為非特異性免疫細胞，包括LAK、細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)及NK細胞等；另一類為特異性免疫細胞，包括TILs、細胞毒性T細胞(CTL)以及經基因修飾改造的T細胞?；蛐揎椉夹g的發展使T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR)基因轉導進入傳統的T細胞成為可能。將TCR的α和β鏈的編碼基因導入T細胞產生腫瘤相關抗原(TAA)的特異TCR-T細胞[27]，可識別多種抗原，如MAGE-A3和NY-ESO-1在黑色素瘤和滑膜肉瘤患者中顯示出良好的效果[28]。CAR由細胞外抗原識別域(單鏈可變片段)和細胞內信號域組成，CAR-T治療是利用CAR改造的T淋巴細胞進行適應性免疫療法，CAR-T細胞可以以不依賴MHC的方式識別腫瘤抗原。CAR-T細胞療法在肉瘤治療中具有廣闊的前景，如在復發/難治性肉瘤患者中使用HER2特異性CAR-T細胞進行的1/2期臨床研究表明，17例患者中有4例的病情穩定12周～14個月，無嚴重毒性[29]。另一方面，CAR-T細胞治療也會產生多種不良反應有關，包括細胞因子釋放綜合征和“腫瘤外”毒性，其中一些不良反應是致命的。細胞因子釋放綜合征是由活化淋巴細胞介導的腫瘤細胞清除反應引發低血壓、發燒和神經系統的變化等臨床反應[30]?！澳[瘤外”毒性是由于識別正常細胞表面的腫瘤相關抗原被錯誤識別，隨后引起淋巴細胞攻擊，對正常組織造成損害。CAR-T細胞即使在靶抗原表達水平較低的情況下，也可通過靶抗原殺死正常細胞，因此CAR-T細胞療法應用于癌癥需要相關抗原的特異表達，還需要對腫瘤高特異性TAAs進一步研究，但采用TCR或CAR靶向TAAs的過繼細胞治療為肉瘤患者提供了一種新的治療方法，需要進行隨機臨床試驗來評估其有效性和安全性。

4 免疫檢查點抑制劑的應用

使患者免疫功能正?；鳛橐环N治療概念在多種腫瘤中的作用得到證實，免疫正常化即通過糾正TME中的免疫缺陷恢復體內正常的抗腫瘤免疫能力是腫瘤免疫療法的主要策略[31]。CTLA-4和程序性死亡受體-1(PD-1)是表達于T細胞上的主要抑制受體，被認為是腫瘤細胞免疫抑制的重要組成部分，也是各種類型晚期惡性腫瘤新的治療靶點[32]。例如在TME中，TILs分泌的IFN-γ誘導腫瘤細胞中PD1配體1(PD-L1)表達，進而引發PD-1在T細胞上的聚集、細胞凋亡和衰竭信號的傳遞，最終導致T細胞功能障礙，腫瘤通過逃避免疫監視發生免疫逃逸現象[33]。阻斷PD-L1/PD-1通路可阻止T細胞功能障礙，恢復TME中的免疫反應，并逐漸探索應用于骨肉瘤的治療[34]。有報道稱，PD-L1等檢查點分子在骨肉瘤細胞上的表達與骨肉瘤的轉移和總生存率有關，抗PD-1單克隆抗體在少部分骨肉瘤患者(5%)中產生客觀反應，但也有11%的患者發生與治療相關的嚴重不良事件[35]。由于TME相關的免疫逃逸機制是高度異質性的，PD-1/PD-L1抗體只對少于40%的實體瘤有作用[36]，長時間持續性的抗PD-1或抗PD-L1治療對腫瘤治療并不能達到期望的生存率[37]。此外，聯合使用抗CTLA-4和抗PD-L1抗體的免疫療法提高了骨肉瘤小鼠模型的整體存活率，而單獨使用抗CTLA-4抗體治療沒有發現任何好轉，接受CTLA-4和PD1/PDL1的聯合免疫療法的腫瘤患者的反應率有所提高，但同時也增加了免疫相關的不良反應及治療成本，長期隨訪發現，這些患者在5年的總體生存率上差異很小[38]。進一步的基礎和臨床研究將決定免疫檢查點抑制劑的療效。另外，高水平基因組不穩定性的存在可能會增強針對免疫檢查點通路的作用，如在多種腫瘤類型中，高突變負荷和對靶向PD1和PDL1的藥物的總體反應率之間存在顯著的相關性[34]，在骨肉瘤中也觀察到了基因組不穩定。到目前為止，CTLA4、PD1以及PDL1的阻斷劑尚未用于骨肉瘤患者。因此，可以考慮將具有非重疊毒性特征的治療方案進行組合，如免疫檢查點阻斷劑和溶瘤病毒的聯合應用來提升免疫療法效果[39]。

綜上所述，盡管化療的使用顯著改善了骨肉瘤的治療效果，但在過去的三十年里，骨肉瘤的治療并未有顯著的改善，主要原因是骨肉瘤的罕見性、異質性以及尚未發現腫瘤特異性抗原。隨著近年來對腫瘤微環境、腫瘤侵襲轉移機制、抗腫瘤免疫系統和腫瘤免疫檢查點等方面的研究的逐漸深入，部分惡性腫瘤的預后明顯改善，因此免疫療法對于骨肉瘤患者來說是極富吸引力的治療選擇。細胞因子、腫瘤疫苗(或多肽疫苗)、免疫細胞和免疫檢查點抑制劑等方法雖然在一定程度上改善了部分骨肉瘤患者的預后，但還需要更多的研究來降低細胞因子治療中的毒性反應、明確骨肉瘤相關特異抗原及其適應證、提高免疫細胞治療的有效性和安全性及設計新的免疫檢查點抑制劑與其他療法的聯合應用方案，因此闡明免疫監測的狀態，發現骨肉瘤腫瘤特異性抗原[40]，以及協同多中心研究1對于骨肉瘤免疫療法的成功是必不可少的。