單次大劑量、多次小劑量環磷酰胺腹腔注射構建小鼠免疫抑制模型對比觀察

李燕華，梁月琴，夏洪穎，王崇靜，李仲昆

昆明市延安醫院，昆明 650051

免疫器官、免疫細胞和免疫分子共同組成了免疫系統，是對抗感染和腫瘤至關重要的因素[1]。近年來，由環境污染、生態失衡等所引發的免疫抑制性疾病的發病率逐年上升，而建立適合的免疫抑制模型對進一步研究該類疾病尤為重要[2]。環磷酰胺(CY)是一種抗腫瘤藥物，其也具有顯著的免疫抑制作用[3]，是治療免疫疾病的常用藥物，特別在作為聯合應用的免疫調節劑和抗腫瘤藥物方面已廣泛應用[4,5]。CY在抑制癌細胞增殖的同時，也抑制免疫細胞的增殖，可造成機體免疫應答(包括體液免疫和細胞免疫)的全面抑制。因此，許多國家和國際機構均推薦CY作為免疫毒性的陽性物[6～8]。采用CY建立免疫抑制模型的方法常采用單次大劑量(100、150 mg/kg)和多次小劑量[20、40、80 mg/(kg·d)]兩種給藥方法，但是較大劑量[80 mg/(kg·d)]腹腔連續注射3 d后可造成實驗后期動物的死亡[9]。為減少實驗動物的病死率，提高造模的成功率，為免疫抑制實驗模型的建立提供參考，本研究采用單次大劑量注射和小劑量多次注射的給藥方法制備小鼠免疫抑制模型，并對小鼠的體質量及末次注射CY后24 h的臟器指數、腸道黏膜派氏結(PPs)計數、腸道黏膜PPs淋巴細胞表型、腸道黏膜SIgA含量等免疫指標進行比較，旨在為選擇CY制備免疫抑制模型時的合適劑量提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級ICR雄性小鼠30只，6～8周齡，體質量(20±2)g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK(湘)2011-0003。

1.2 藥物、試劑及儀器 0.9%氯化鈉注射液(四川科倫藥業股份有限公司，生產批號ad160201b2)；注射用CY(江蘇盛迪醫藥有限公司生，批號17102525)；DAB試劑盒(北京中杉金橋生物科技有限公司)。抗小鼠CD3e-FITC、抗小鼠CD19-PE、CD69-PE-CYTM7(美國BD-Pharmingen公司，批號分別為553062、557399、552879)；Anti-TLR4 antibody試劑盒(Abcam公司，批號GR325034-5)；胎牛血清(FBS)(法國Biowest公司，批號020413-UY)；改良型RPMI1640培養基[賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司，批號NAC1361]。FACSCalibur流式細胞儀(FC-500)(美國Beckman公司)；全自動酶標儀Model 550(美國BIO-RAD公司)；LEGEND MICRO 17臺式微量離心機(美國 Thermo公司)；倒置相差顯微鏡(BDS200)(重慶奧特光學儀器有限責任公司)；TD5M低速多管架自動平衡離心機(長沙萬佳森儀器設備有限責任公司)；光學顯微鏡(Nikon50i)：日本Nikon公司；FA2004電子分析天平(上海精密科學儀器有限公司)；血球計數板(上海市求精生化試劑儀器有限公司)；Cell Strainer(100 μm,70 μm)(美國Falcon公司)；眼科剪、眼科鑷。

1.3 實驗動物分組及免疫抑制模型制備 將ICR健康雄性小鼠適應性暫養1周后，稱重、標記，后隨機分為單次組、多次組、對照組各10只。單次組在實驗第7天腹腔注射100 mg/kg的CY，多次組在實驗第1、3、5、7 d腹腔注射50 mg/(kg·d)的CY，以免疫抑制模型；對照組在實驗第1、3、5、7 d腹腔注射等量生理鹽水。各注射后自由取食飲水。

1.4 小鼠體質量測定 采用電子秤測定實驗第1、3、5、7、8 d每只小鼠的體質量，并記錄。

1.5 小鼠處死及相關指標測定 實驗第8 d，以頸椎脫臼法處死小鼠30只，按下列步驟測定小鼠臟器指數、腸黏膜PPs計數、腸黏膜CD3+、CD19+細胞比例測算、小鼠腸道黏膜SIgA。

1.5.1 小鼠臟器指數測定 沿胸部和腹部中線切開小鼠，按解剖位置摘取脾臟和胸腺，小心剔除其周圍的筋膜及組織，濾紙吸干殘余的血液后進行稱重(g)，將稱得的重量(g)除以小鼠體質量(g)，計算胸腺指數和脾臟指數，脾臟指數(%)=脾臟重量(g)/小鼠體質量×100，胸腺指數(%)=胸腺重量(g)/小鼠體質量×100。

1.5.2 小鼠腸黏膜PPs計數 打開小鼠腹腔，取出全段小腸，迅速放入含有5%胎牛血清(5%FBS)的RPMI1640液的培養皿中，剔除腸系膜及腸黏膜表面的脂肪組織，在外腸壁上可看見麥粒樣的圓形突起，即為PPs[10]，肉眼計數并記錄PPs數目。

1.5.3 小鼠腸黏膜CD3+細胞比例、CD19+細胞比例測算 PPs淋巴細胞獲取及表型測定 肉眼計數并記錄PPs數目完成后，將小鼠腸腔沖洗干凈，迅速放入含5%FBS的RPMI1640液的培養皿中；用眼科鑷和眼科剪小心分離出PPs；將其浸入含5%FBS的RPMI1640液的培養皿中，先用5%FBS的RPMI1640液浸潤120目細胞篩，并將PPs小心移入細胞篩中，用研磨棒以適當的力度輕輕研磨，再用5%FBS的RPMI1640液沖洗細胞篩過濾；以上濾液用200目細胞篩過濾；收集濾液，加至5 mL，以2 000 r/min速度離心10 min，棄上清液，加入5%FBS的RPMI1640液約3 mL，重懸細胞即得PPs細胞懸液。將收集到的PPs細胞計數并調節細胞濃度至1×107/mL，分別取100 μL細胞加入流式檢查專用試管中進行熒光標記，每管依次加入抗小鼠CD3e-FITC、CD19-PE單克隆抗體各0.5 μg，混勻后4 ℃避光孵育30 min，用PBS洗滌細胞兩次(1 500 r/min，5 min)，棄上清，用PBS 300 μL重懸后進行流式細胞儀檢測[10]。

1.5.4 小鼠腸道黏膜SIgA測定 取出全段小腸，用帶有灌胃針的10 mL注射器向腸腔內注入NS約3 mL，并在小腸內保留3 min，輕輕晃動使腸腔內的內容物充分溶解，將腸腔內灌洗液收集于EP管中，以3 000 r/min的速度離心10 min，收集上清液于凍存管，-80 ℃儲存，編號備用。待樣本收齊后，嚴格按酶聯免疫技術(ELISA)鼠SIgA試劑盒說明書操作[10]，即取100 μL不同濃度梯度的標準品、樣品、陽性對照品和空白分別加入酶標板，37 ℃孵育2 h；用拍板紙拍干板子，不洗板；提前20 min配制Detection reagent A工作液；加入100 μL Detection reagent A工作液到酶標板，輕輕震蕩混勻，37 ℃孵育60 min；洗板3次；每個孔加300 μL 1×洗液工作液放置2 min后用拍板紙拍干板子；提前20 min配制Detection reagent B工作液；加入100 μL Detection reagent B工作液到酶標板，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光孵育30 min；洗板5次；加入90l顯色底物(TMB)到酶標板，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光孵育15 min；加入50 μL終止液到酶標板，輕輕震蕩混勻，用酶標儀在450 nm處檢測標準品和樣本OD值；以OD值為縱坐標，以標準品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，根據OD值在標準曲線上查出濃度。

2 結果

2.1 不同時點各組小鼠體質量比較 不同時點小鼠體質量比較見表1。

表1 不同時點各組小鼠體質量比較

注：與空白組比較，aP<0.05；與多次組比較，bP<0.05。

2.2 各組脾臟指數、胸腺指數比較 脾臟指數、胸腺指數比較見表2。

2.3 各組腸黏膜PPs計數、CD3+細胞比例、CD19+細胞比例、腸道黏膜SIgA含量比較 腸黏膜PPs計數、CD3+細胞比例、CD19+細胞比例、腸道黏膜SIgA含量比較見表3。

表2 各組脾臟指數、胸腺指數比較

注：與空白組比較，aP<0.05；與多次組比較，bP<0.05。

表3 各組腸黏膜PPs計數、CD3+細胞比例、CD19+細胞比例、腸道黏膜SIgA含量比較

注：與空白組比較，aP<0.05；與多次組比較，bP<0.05。

3 討論

免疫系統的各種細胞、組織和器官的組成成分和功能的正常是機體免疫功能的基本保證，任何一方面的缺陷都將導致免疫功能障礙。機體自發、病原或藥物、營養因素、環境因素均可引起免疫系統的功能異常，進而導致功能障礙、免疫應答和保護功能的降低或消失，最后引發機體喪失抵抗感染能力或形成免疫性疾病，容易受到細菌、病毒、真菌等感染，甚至容易長腫瘤[11～13]。目前，對免疫抑制性疾病的治療主要以調整機體的自身免疫功能為主，免疫增強劑在醫學上的應用已經引起了人們的廣泛關注[14]。中藥免疫增強劑是目前使用較多的免疫增強劑，它可激活免疫活性細胞，增強機體的免疫功能；還可作為輔助藥物與一些疫苗合用，增強免疫應答，提高免疫效應；主要用于一些免疫功能缺陷及難治性感染。但其僅在動物飼料添加中使用較為廣泛；在臨床使用方面，受到一定的限制，需要進入深入的研究開發[15]。為此，建造安全有效的免疫抑制動物模型顯得尤為重要。在生命科學研究中，免疫抑制動物模型建造的主要方法包括去胸腺動物模型、基因敲除動物模型、輻射損傷模型和免疫抑制劑模型等[16～18]，其中使用免疫抑制劑進行建模的方法由于總體成本較低、操作簡便并且重復性好，因此在目前的研究中廣泛應用。用于建立免疫抑制動物模型的免疫抑制劑包括微生物酵解產物類、激素類、抗代謝物類、抗體類、烷化劑類等，其中烷化劑類免疫抑制劑是建立的免疫抑制模型研究中最常用的方法。烷化劑按化學結構可分為氮芥類、磺酸酯及多元醇類、亞硝基脲類、三氮烯咪唑類和胼類、乙撐亞胺類。

CY是一種抗腫瘤藥物，對白血病和實體瘤都有效，是第一個所謂“潛伏化”廣譜抗腫瘤藥。CY是一種無活性的前藥，在氮芥部分上連有一個吸電子的環狀磷酰基，降低了烷基化的能力，體外幾乎無活性，當其進入人體后，被肝臟或腫瘤內存在的過量的磷酰胺酶或磷酸酶水解，變為活化作用型的磷酰胺氮芥而起作用的氮芥類衍生物。磷酰胺氮芥作為烷化劑的一種在體內能和細胞的蛋白質和核酸相結合，使蛋白質和核酸失去正常的生理活性，發揮其抑制腫瘤細胞生長的作用，同時由于其非特異性，也會產生針對骨髓、胃腸道上皮和生殖系統等生長旺盛的細胞毒性；此外，還對免疫器官和敏感的淋巴細胞產生影響，進而對免疫功能產生明顯抑制。可用于乳腺癌、惡性淋巴瘤，多發性骨髓瘤、白血病、卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌、結腸癌、支氣管癌、肺癌等腫瘤的化療；還可作為免疫抑制劑用于各種自身免疫性疾病，如天皰瘡以及潰瘍性結腸炎、嚴重類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡、多發性肉芽腫、特發性血小板減少性紫癜、兒童腎病綜合征等，以及用于器官移植時抗排斥反應[19～23]。CY因其效果穩定、較易獲得同時成本不高，常用于建立免疫抑制模型并有較多的文獻報道，因而被廣泛接受并應用于藥物藥效學評價和安全性評價。

文獻[6]報道，實驗動物腹腔注射CY后，可導致動物體質量不同程度的降低，這與使用CY的劑量和時間有關，尤其是在注射后的第1周，但大劑量單次注射體質量明顯高于小劑量連續注射組。與空白組比較，單詞組實驗第8天及多次組實驗第3、5、7、8天體質量降低；與多次組比較，單次組實驗第3、5、7、8天體質量升高。脾臟是機體最大的外周免疫器官，當抗原刺激機體后，免疫細胞(T細胞、B細胞和巨噬細胞)過度增生，導致其體積增大；胸腺是機體的中樞免疫器官，是T細胞分化成熟的場所；而機體免疫抑制時，使得淋巴組織萎縮，免疫器官的體積縮小。故免疫器官的臟器指數體現了其發育情況，可間接的反映機體的免疫狀態。本研究顯示，單次組和多次組均出現了脾臟指數和胸腺指數的降低，且單次組較多次組明顯，間接說明兩組實驗動物均存在免疫抑制，且單次組較多次組明顯。PPs是沿著小腸縱向分布位于膜系膜固有層和黏膜下層的微小淋巴樣組織，含有胸腺源性T細胞和B細胞，其中心區域富含B細胞，是誘導腸道黏膜進行免疫應答的重要部位，PPs淋巴細胞數量和活性狀態等可以反映腸道黏膜局部的免疫功能狀態。CD3+T淋巴細胞代表總的T淋巴細胞，而CD19+是B淋巴細胞表面抗原，除了漿細胞外的B細胞譜系所有發育階段都有CD19分布，CD19也是CD19/CD21/CD81信號復合物的重要組成部分，故CD19+代表了PPs內除了漿細胞外的B細胞譜系不同發育階段B細胞的總和。在既往的研究中，不同的CY造模實驗均可導致T淋巴細胞、Th細胞、Ts細胞比例升高，B淋巴細胞比例下降[6]。本文發現，單次組和多次組均出現了CD3+細胞比例升高，CD19+細胞比例降低，且單次組較多次組更為明顯，進一步說明兩組實驗動物均存在免疫抑制，造模成功且單次組效果更佳。有研究[9,24]表明，大劑量CY(100 mg/kg)制造免疫抑制模型效果更佳；在連續腹腔注射CY的動物模型中，40 mg/(kg·d)和60 mg/(kg·d)的用量均可完成免疫抑制模型的成功造模[25]，但后者的效果優于前者。康慧琳等[26]發現，高劑量CY通過抑制DNA的復制、促進細胞凋亡，降低免疫細胞功能，使機體處于免疫抑制狀態。免疫效應分子SIgA由腸道黏膜固有層漿細胞分泌，是機體內分泌量最大的免疫球蛋白，也是腸黏膜表面主要的免疫球蛋白，對消化道黏膜起著重要防御作用，當CY免疫引起抑制時，可引起腸道粘膜SIgA水平下降[27]。本研究中，腸道粘膜SIgA的含量也出現了相同的變化趨勢，且以單次組更為明顯。

總之，單次大劑量和多次小劑量的CY均可建立免疫抑制動物模型，前者對體質量影響更小、造模效果更佳。