高壓氧對大鼠急性腦梗死的治療作用及其機制

徐小丹，黃璟，涂濤

成都醫學院第一附屬醫院，成都 610500

急性腦梗死是最常見的腦血管疾病，已被公認為世界范圍內導致死亡和殘疾的第三大原因。高壓氧(HBO)已被作為一氧化碳中毒、減壓病、動脈氣體栓塞的主要治療手段之一，另外對中風模型和脊髓、心、肝臟等器官有缺氧耐受的神經保護作用[1～3]。缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)是缺氧誘導基因轉錄過程中的關鍵環節和共同信號傳遞通路[4]，是大腦對缺氧反應的主開關，不但參與了缺氧時的血管生成和葡萄糖代謝的調節[5]，而且在細胞凋亡、炎癥活性的發展中起著關鍵作用[6]。盡管HIF-1α在腦缺血大鼠中被廣泛認為是上調的，然而接受HBO治療后HIF-1α作用如何目前尚不清楚。2018年2月～2019年3月，本研究通過建立腦梗死大鼠模型，并給予HBO治療，觀察對其大鼠急性腦梗死的治療作用，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 雄性SD大鼠150只，2月齡，體質量180～200 g。所有動物在飼養期間自由攝食和飲水。隨機分為治療組(60只)、模型組(60只)、對照組(30只)。所有外科手術均經動物實驗倫理委員會批準，并按照我院動物實驗指南進行。

1.2 急性腦梗死模型制備 無菌自然干燥的血凝塊研碎分級過篩，選直徑100～200目的微粒制成2 mg/mL的鹽水懸濁液即栓塞液。以20%烏拉坦腹腔注射麻醉大鼠，暴露左側頸總動脈及頸內、外動脈，暫時夾閉頸總動脈，治療組和模型組大鼠從頸外動脈處逆行穿刺插管注入0.3 mL栓塞液，對照組注入同體積的生理鹽水，后結扎頸外動脈，放開頸總動脈，使栓子通過頸內動脈進入顱內至大腦各動脈，逐層縫合傷口。模型制備成功標準：大鼠清醒后出現左側綜合征左側眼裂變小、瞳孔縮小、右側偏癱(以右前肢為明顯)、提尾懸拉后右前肢蜷縮屈曲或被動性過度伸展、同時出現向右轉圈跌倒。如果大鼠術中死亡或模型未成功，則剔除后增補。

1.3 HBO治療方案及標本取材 治療組參照陳清華等[7]的方法進行HBO治療，每天治療1次。治療過程：20 min內表壓升至0.15 MPa，穩壓吸氧1 h，20 min內減至常壓后大鼠出艙。模型組的大鼠被放置在沒有加壓進行假治療的房間中，時間與治療組相同。室內溫度保持在22～25 ℃，使用裝有碳酸鈣晶體的小容器可防止二氧化碳的積聚。為了盡量減少白天變化影響，所有暴露都在上午8∶00開始。在高壓氧治療1、3、7、14、21、28 d(分別計為T1、T2、T3、T4、T5、T6)，將治療組、模型組(每個時點取10只)和對照組(每個時點取5只)進行神經功能評分，完成評分后分別用烏拉坦(1.5 g/kg)腹腔注射深麻醉后斷頭處死，取5只大鼠腦組織用于測定腦梗死體積及HIF-1α陽性神經元數，剩余5只大鼠腦組織用于檢測腦組織含水量及HIF-1α mRNA相對表達量。

1.4 大鼠神經功能評分 按Bederson氏4級評分標準并稍作修改，觀察各組全部動物行為的變化并進行評分，0分為沒有明顯的神經功能缺失，1分為右側前爪不能伸直，2分為行走時向缺血側傾斜或劃圈，3分為不能行走或右側肢體反射消失。分值越高說明大鼠活動障礙越重。

1.5 大鼠腦梗死體積測算 將腦快速放于冰盤上，從前額1 mm處開始，切成5個2 mm的冠狀切面。用2%的2，3，5-三苯基四唑氯銨(TTC)在0.2 mol/L PBS(pH 7.4)中進行組織學染色30 min，正常腦組織染成紅色，梗死腦組織呈白色，再用4%多聚甲醛溶液固定后拍照留存。應用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告分析系統測出梗塞灶每一層面梗死面積。用下列公式計算腦梗死灶體積(V)，V=dA(d為截面間距，A為截面面積)。

1.6 大鼠腦組織含水量測算 在各時間點切取每只大鼠約100 mg的皮層腦組織，用電子天平稱大鼠腦組織濕重后置于105 ℃恒溫烤箱中烘干，24 h后冷卻稱重。用下列公式計算腦組織含水量(X)，X=(A-B)/A×%(A為腦組織濕重，B為腦組織干重)。

1.7 大鼠腦組織HIF-1α陽性神經元檢測 采用免疫熒光染色檢測。腦組織用4 %多聚甲醛固定，石蠟包埋。切片預先處理后采用兔抗HIF-1α(Abcam公司，1∶50)和鼠抗NeuN(Abcam公司，公司1∶200)孵育，PBS洗滌后，用熒光二級抗體山羊抗兔IgG(Abcam，1∶500)和抗鼠IgG(Abcam公司，1∶100)孵育，然后用PBS沖洗切片，用DAPI固定。最后用熒光顯微鏡(Olympus/BX51)以400倍的放大率拍照后每張切片隨機觀察5個視野進行細胞計數。

1.8 大鼠腦組織HIF-1α mRNA相對表達量檢測 采用RT-PCR法檢測。根據廠家說明書，用TRIzol試劑分離總RNA，用cDNA合成試劑盒逆轉錄到cDNA上。β-actin的mRNA作為內參。RT-PCR程序步驟：95 ℃持續1 min，45個循環95 ℃持續5 s，60 ℃持續5 s，72 ℃持續20 s。測得目的基因和β-actin 基因的循環閾值，根據標準曲線換算目的基因與β-actin 基因的拷貝數，以二者比值表示目的基因的相對表達量。

2 結果

2.1 不同時點各組神經功能評分比較 不同時點各組神經功能評分比較見表1。

表1 不同時點各組神經功能評分比較(分，

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

2.2 不同時點各組腦組織含水量比較 不同時點腦組織含水量比較見表2。

表2 不同時點各組腦組織含水量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

2.3 不同時點各組腦梗死體積比較 不同時點腦梗死體積比較見表3。

表3 不同時點各組腦梗死體積比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

2.4 不同時點各組腦梗死區域HIF-1α陽性神經元數比較 不同時點腦梗死區域(皮質和海馬)HIF-1α陽性神經元數比較見表4。

2.5 不同時點各組腦梗死區域HIF-1α mRNA相對表達量比較 不同時點腦梗死區域HIF-1α mRNA相對表達量比較見表5。

表4 不同時點各組腦梗死區域HIF-1α陽性神經元數比較(個，

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

表5 不同時點各組腦梗死區域HIF-1α mRNA相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

3 討論

急性腦梗死是導致中老年人癱瘓的主要疾病，嚴重影響患者的生存質量。急性腦梗死臨床上以猝然昏倒、言語障礙、偏癱為主要特征，治療措施有常規治療和溶栓治療，常規治療包括改善腦供血及腦微循環、腦保護、抗血栓治療、預防并發癥等，但效果不佳。而組織纖溶酶原激活劑(tPA)作為目前FDA惟一批準的治療缺血性卒中藥物，由于時間窗太短，僅被應用于2%～5%的急性腦梗死患者[8]。近年來，隨著對腦梗死發病機制研究的日益深入，其治療方面己有了長足的進步，但仍有機制尚不清楚。

HBO是一種有效的治療方法，可以改善許多疾病的進展，尤其是缺氧相關的損傷[9]，已被廣泛應用于臨床。研究[10]表明，HBO促進神經功能恢復，然而主要應用于腦梗死初發后數天或數周，不是為了減少梗死，而是改善后期的神經行為功能。因此，早期HBO治療對腦梗死神經保護作用及其機制尚未研究。本研究顯示，對照組不同時點神經功能評分均為0分，表明無神經功能缺損；相比之下，大鼠腦缺血后出現嚴重的神經功能缺損，并隨著時間的推移逐漸下降；與模型組相比，治療組評分明顯降低，但仍高于對照組。這證實腦缺血損傷導致神經功能障礙，而HBO治療可以抑制這種損傷的進展。腦梗死的梗死灶內因缺血缺氧致各種細胞脫氫酶活性下降或失活，TTC染色時不能產生變化呈蒼白色，鮮明的顏色對比較易顯示出梗死范圍，故常用于腦梗死造模成功與否的評價。本研究顯示，對照組大鼠無缺血損傷，呈紅色染色，而治療組梗死區域較模型組明顯減輕。腦組織含水量在彌散性腦損傷后就可檢測到較對照組明顯增高，在第3天時達到最高峰，隨后逐漸吸收，至28天檢測結果仍然高于對照組水平，而HBO能使顱內血管收縮，從而減少滲出。這些結果表明HBO治療可顯著降低腦缺血損傷時的梗死體積和水腫程度。

當腦組織在一定范圍內的缺血缺氧時，會主動合成一些調節因子來減輕缺血缺氧帶來的損傷，越來越多的證據發現HIF-1α是機體啟動的最強內源性保護因子，它被激活后所產生的生物學效應是調節缺氧反應性基因表達的共同分子通路[11～13]。在缺血條件下，HIF-1α可促進參與能量代謝、血管生成和細胞存活的多種蛋白的轉錄，這些蛋白可作為抗缺血性腦損傷的神經保護劑[14]。另外HIF-1α可間接影響中性粒細胞向缺氧半影的浸潤，這被認為是缺血性腦損傷的主要原因[15]，因此HIF-1α是腦缺血損傷后炎癥反應進展中的關鍵分子。HBO治療對腦缺血大鼠具有神經保護作用，其分子機制可能與HIF-1α的變化有關，主要表現在保護血腦屏障的完整性、調節蛋白合成與神經活性[16,17]和減少活性氧的產生[18]。另外據Liu等[19]報道，HIF-1α通過抑制血管內皮生長因子、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9和促紅細胞生成素凋亡途徑，改善梗死區血管生成。本研究顯示，模型組和治療組HIF-1α的mRNA水平在第1、3、7天均高于對照組，且在損傷后1天達到最大峰值。腦缺血損傷誘導大腦梗死區域HIF-1α的mRNA和蛋白水平的增加，這可能代表了神經元受到缺血損傷的反應，而治療組在腦缺血早期明顯增強。因此，刺激HIF-1α表達可能是HBO誘導的神經保護的關鍵機制，這與Cheng等[20]報道的結果一致。另外HIF-1α在大鼠腦損傷后腦組織中的表達與腦損傷后腦組織的含水量均處于一個動態的高表達狀態。其機制可能是隨著時間的延長，其腦水腫逐漸被吸收，對周圍組織的壓迫減輕，從而使其缺氧較前改善，故其表達呈下降趨勢。鑒于HIF-1α在腦損傷超早期對神經細胞的保護作用，通過增加HIF-1α在腦損傷后的早期表達可作為控制腦水腫的一個有效辦法。

總之，HBO治療能顯著降低腦缺血所致的損傷，其機制與刺激HIF-1α的過度表達有關。