2型糖尿病大鼠辛伐他汀灌胃治療后胸主動脈壁細胞凋亡情況及細胞凋亡相關基因、活性氧簇表達觀察

姚蓉飛，劉鵬，任秋月，周勝男，常柏

1天津醫科大學朱憲彝紀念醫院，天津 300134；2天津市內分泌研究所；3國家健康委員會激素與發育重點實驗室；4天津醫科大學；5天津中醫藥大學；6泰達國際心血管病醫院

隨著我國經濟的發展和人們生活水平的提高，糖尿病的患病率呈現迅猛增長趨勢，其中2型糖尿病(T2DM)約占糖尿病患者的90%。大血管病變是糖尿病常見的慢性并發癥之一，也是導致糖尿病患者致殘和致死的主要原因。通過調節細胞凋亡相關基因的表達，就有可能改善血管內皮細胞的凋亡情況，從而延緩糖尿病大血管病變的發生和發展。以往大量研究證實，他汀類藥物在抗血管炎癥、抗血栓、抗氧化應激、免疫調節、改善內皮細胞功能及抗凋亡等有顯著效果[1]。周衛鳳等[2]通過建立體外高糖誘導的內皮細胞模型，發現辛伐他汀對血管內皮細胞的保護作用可能與細胞凋亡有關，但其作用機制尚不明確。糖尿病大血管病變主要涉及心、腦血管等，因此本研究選取糖尿病大鼠胸主動脈為研究對象。本研究通過制備大鼠T2DM模型，并灌胃給予辛伐他汀，觀察T2DM大鼠辛伐他汀灌胃治療后胸主動脈壁病理組織學、細胞凋亡情況及細胞凋亡相關基因、ROS表達情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠60只，4周齡，體質量(100.3±2.2)g，由天津實驗動物中心提供[動物合格證號：SCXK(津)2014-001]。

1.2 藥物、試劑及儀器 鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司；辛伐他汀片購自輝瑞制藥有限公司(10 mg/片，產品批號國藥準字J20070060)。超純RNA提取試劑盒購自天津生化科技有限公司,大鼠活性氧(ROS)ELISA試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司。PCR擴增儀；5810R臺式低溫高速離心機；JEM-1230透射電子顯微鏡。

1.3 T2MD模型制備、分組及辛伐他汀灌胃方法 取SD雄性大鼠60只，適應性喂養1周。隨機選取40只大鼠，給予高脂飼料(20%蔗糖+1%膽固醇+10%豬油+5%蛋黃粉+0.2%膽酸鈉+63.8%普通飼料)喂養，8周后采用尾靜脈注射STZ(30 mg/kg)誘導方法制備T2DM模型[3]；制模3 d后，對大鼠尾靜脈采血測血糖，隨機血糖超過16.9 mmol/L的大鼠視為T2MD大鼠模型成功制備；最終造模成功的大鼠34只，未成模大鼠直接剔除；成模后的T2DM大鼠，按體質量、血糖分層隨機分為辛伐他汀組、模型組各17只。另選取20只大鼠作為正常對照組，給予標準飼料喂養。根據人鼠等效劑量，辛伐他汀組以1.05 mg/(kg·d)辛伐他汀溶液灌胃1次，模型組和正常對照組每日給予等量無菌飲用水灌胃1次，各組大鼠灌胃時間均為16周。

1.4 大鼠胸主動脈內皮細胞透射電鏡病理變化 16周后，各組大鼠以頸椎脫臼處死后，每組解剖7只大鼠，分離胸主動脈組織2 cm左右。標本切成0.9 mm3大小，在4 ℃下用2%戊二醛固定后，脫水處理，用環氧樹脂812浸泡、包埋，經檸檬酸鉛雙重染色后切片。在透射電鏡下觀察內皮細胞病理改變。

1.5 大鼠胸主動脈Apaf-1、AIF、Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA檢測方法 每組取10只大鼠處死，取胸主動脈組織，采用Real-time PCR法檢測胸主動脈組織中Apaf-1、AIF、Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA。用超純RNA提取試劑盒提取組織樣本中總RNA。取5 μL RNA用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，以檢測RNA的完整性。使用DNase Ⅰ試劑盒對RNA中殘留的基因組DNA進行消化處理后，HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉錄。所用引物序列如下：Apaf-1 PCR擴增片段長度為149 bp，上游引物5，-TATGCAAGAACTCTGCCATC-3′，下游引物5′-GAATGCCACGTACTCAAGGT-3′；Bcl-2擴增片段長度為112 bp，上游引物5′ -TGCCACCTGTGGTCCATCTG-3′，下游引物5′-TGAAGAGTTCCTCCACCA-3′；Bax擴增片段長度為129 bp，上游引物5′-TCATCCAGGATCGAGCAG-3′，下游引物5′-CGTGTCCACGTCAGCAATCA-3′；AIF擴增片段長度為137 bp，上游引物5，-TAAGCCATACTGGCATCAGTC-3，下游引物5′-ACTCTCCGAACGGATACCAG-3′；Caspase-3擴增片段長度為142 bp，上游引物5′-TACTGCCGGAGTCTGACTG-3′，下游引物5′-CTCCAGGAATAGTAACCAGG-3′。應用ABI 7500型熒光定量PCR儀，采取2-ΔΔCT法進行數據的相對定量分析。

1.6 大鼠胸主動脈ROS檢測方法 處死各組大鼠前1 h，股動脈取血3 mL，使自然凝固后離心，取上層血清，用于酶聯免疫吸附法檢測。用梯度稀釋的方式加樣，混勻，然后按照ROS ELISA試劑盒使用說明書進行試驗。結果以OD值表示。

2 結果

2.1 各組大鼠胸主動脈內皮細胞電鏡下變化 正常對照組內皮細胞細胞核清晰，形態完整，有條索樣連接緊密、連續(圖1a)；模型組內皮細胞可見明顯細胞核固縮、線粒體腫脹，及內皮細胞碎片(圖1b)；辛伐他汀組較模型組病理損傷較輕，內皮細胞相對連續，完整，有輕度腫脹，但未見明顯細胞核固縮(圖1c)。

圖1 各組大鼠胸主動脈內皮細胞電鏡下形態

2.2 各組大鼠胸主動脈Apaf-1、AIF、Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA及ROS表達比較 大鼠胸主動脈Apaf-1、AIF、Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA及ROS表達比較見表1。

表1 各組大鼠胸主動脈Apaf-1、AIF、Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA及ROS表達比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

3 討論

研究[4,5]顯示，糖尿病已成為嚴重危害我國人民健康的三大慢性疾病之一，而高糖環境誘導血管內皮細胞凋亡是糖尿病導致動脈粥樣硬化病變的關鍵環節。糖尿病大血管病變導致的心、腦、下肢動脈及外周大血管損傷，是糖尿病患者死亡的主要原因。臨床常見心血管疾病包括急性冠狀動脈綜合征，陳舊性心肌梗死、穩定性或不穩定性心絞痛等，糖尿病都是其獨立危險因素。而糖尿病導致的以下肢麻木、靜息痛、間歇性跛行、皮溫低等明顯癥狀的下肢血管病變，嚴重影響患者的生存質量。根據大量臨床試驗研究顯示，單純嚴格控制血糖對糖尿病大血管病變在短期內無明顯獲益[6]。

辛伐他汀是糖尿病、心血管不良事件一線預防藥物，廣泛應用于臨床。他汀類藥物含有羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，其能夠有效降低總膽固醇的合成，同時通過促進LDL-c的分解，從而降低LDL-c水平。根據美國糖尿病學會(ADA)的建議，無論基線低密度脂蛋白膽固醇濃度如何，糖尿病患者和年齡在40～75歲的心血管病史都應給予他汀類藥物[7]。一些大規模的隨機對照試驗證實，他汀類藥物在預防糖尿病患者心血管疾病發病率和病死率方面的功效[8]。一項薈萃研究顯示，他汀類藥物可使糖尿病患者的冠狀動脈事件減少21%，中風減少36%[9]。同時臨床試驗表明，辛伐他汀能夠有效降低T2DM患者體內炎癥因子如白介素-6、腫瘤壞死因子α等的釋放，從而降低其全身炎癥反應[10]。任天舒等[11]發現，他汀類藥物可以有效提升超氧化物歧化酶高活性，從而增強機體對自由基的能力清除能力，減少氧化形成氧化型低密度脂蛋白生成，減少其對組織的損傷，最終抑制血管斑塊的形成。本研究顯示，在電鏡下，模型組大鼠內皮細胞可見明顯細胞核固縮、線粒體腫脹；而辛伐他汀組內皮細胞損傷則明顯較模型組輕，內皮細胞相對完整。說明辛伐他汀能夠有效保護血管內皮，延緩糖尿病大血管病變的發展。

文獻[12]報道，血管內皮損傷在糖尿病前期就已存在，內皮細胞凋亡是糖尿病大血管病變的始動因素。內皮細胞凋亡不僅造成血管內皮結構的損害，還嚴重影響內皮細胞的正常功能，促進血管病變的發生。細胞凋亡的經典通路中，而線粒體通路是最為主要的。當細胞受到一定刺激誘導線粒體通透轉換孔開通，引起線粒體外膜透化(MOMP)，后線粒體膜電位(MMP)去極化，MMP的丟失可觸發線粒體釋放細胞色素C和膜間蛋白AIF被釋放將進入細胞質中[13,14]。AIF在細胞質中發生AIF線粒體核轉位，引起DNA裂解[15～17]。而Apaf-1在細胞凋亡途徑中通過與細胞色素C的相互作用，形成凋亡小體，誘導凋亡發生標志酶Caspase-3的活化引起Caspase級聯反應[18]，進而裂解核蛋白、細胞骨架、內質網等，造成典型的凋亡形態學改變。Bcl-2家族蛋白也在細胞凋亡過程中起到了重要作用。Bcl-2家族蛋白是由促凋亡和抗凋亡兩部分組成，能夠抑制或激活MOMP，從而決定細胞是否發生凋亡。其中Bcl-2與Bax分別為抑制細胞凋亡因子和促進細胞凋亡因子，其作用完全相反。Bcl-2作用于線粒體外膜，其抗凋亡作用主要是通過抑制細胞色素C釋放和Caspases的激活。而Bax作為Bcl-2家族蛋白之一，能夠導致MOMP促使細胞凋亡，這可能是由于其構象發生改變造成寡聚化，在線粒體外模形成孔道而產生的。同時Bcl-2能夠直接或間接阻止Bax與MOMP結合，從而抑制細胞凋亡。ROS是含氧化合物的總稱。研究發現，高糖能夠刺激細胞ROS的生產，當血管內皮細胞氧化應激損傷后，ROS可引起細胞膜通透性發生改變，最終誘發細胞膜的雙層結構斷裂，促使細胞凋亡。本研究結果顯示，與模型組相比較，辛伐他汀組Apaf-1、AIF、Caspase-3、Bax mRNA及ROS表達降低，Bcl-2 mRNA表達升高，說明在高糖環境下辛伐他汀可以有效的下調促細胞凋亡基因，升高抑制細胞凋亡基因表達水平，從而減少內皮細胞的凋亡進而延緩T2DM大血管病變發生發展。

總之，辛伐他汀可抑制T2DM)大鼠胸主動脈內皮細胞凋亡，機制可能為其可下調Apaf-1、AIF、Caspase-3、Bax mRNA及ROS表達，上調Bcl-2 mRNA表達。