香草乙酮靜注對大鼠肺缺血再灌注損傷的預防作用觀察

張霖，耿慶，范濤，馮浩潔，沈小康

1武漢大學人民醫院，武漢 430060；2湖北省人民醫院

肺缺血再灌注損傷(LIRI)是指多種因素導致肺缺血基礎上恢復血流灌注后肺組織損傷加重的現象。LIRI是醫療中常見的狀況，可見于肺移植、肺動脈血栓剝脫術、體外循環等外科手術和操作[1～3]。LIRI是肺移植術后出現呼吸衰竭的重要原因，影響肺移植成功率。尋找防治IRI的措施，對提高肺移植成功率及移植后患者的遠期生存率具有重要的臨床意義[4]。香草乙酮(APO)是一種NAPDH氧化酶抑制劑，可通過對微小血管活性氧的抑制，減輕急性肺損傷[5]。APO在創傷誘導的大鼠急性肺損傷模型、大腦中動脈閉塞誘導的小鼠缺血性腦卒中模型、小鼠潰瘍性結腸炎模型中均被證明對相應器官有保護作用[6～8]。APO在急性肺損傷模型中的保護作用涉及對NAPDH氧化酶(NOX)的抑制，但其在大鼠在體肺缺血再灌注模型中的作用尚無研究報道。本研究通過建立大鼠LIRI模型，建模前提前靜注APO，觀察APO對LIRI的預防作用，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)；Apocynin(Santa Cruz公司)；抗NOX2抗體、抗NOX4抗體(Thermo Fisher公司)；MPO抗體、免疫熒光二抗(Abcam 公司)；MDA試劑盒、SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所)；EliVision Super檢測試劑盒(福州邁新生物技術開發有限公司)；超氧化物陰離子熒光探針(DHE)試劑(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.2 實驗動物分組、APO靜注方法及LIRI模型制備 SPF級健康雄性SD大鼠24只(由湖北省疾病預防控制中心提供)，體質量 200～250 g。大鼠均在標準環境下自由進食、進水。適應性飼養 3～4 d后，所有大鼠隨機分為APO組、LIRI組、SO組各8只。APO組大鼠在制模前30 min經股靜脈注射10%DMSO溶解的APO(50 mg/kg)[9～11]。APO組和LIRI組均參照楊世疆等[12]的方法制備LIRI模型，即大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉60 mg/kg麻醉，后將大鼠仰臥固定，消毒氣管周圍皮膚，并行氣管插管；調節呼吸機參數，使呼吸比1.0∶1.5；左胸第4肋間入胸，游離左肺門后，尾靜脈注射肝素300 U/kg，5 min后以無創血管鉗夾閉左肺門，以肺門部血管無收縮、左肺無通氣為阻斷成功的指征；60 min后松開血管鉗，形成再灌注；再灌注120 min。SO組僅游離左肺門，不夾閉，其余同LIRI組。制模120 min時放血處死動物，并取左肺組織。

1.3 肺組織病理觀察及病理評分 取部分左肺組織以4%多聚甲醛固定24 h，進行石蠟包埋；取部分石蠟包埋切片，經HE染色后在光學顯微鏡下觀察其病理改變并進行病理評分，評分標準參考Pan等[13]的研究，總共0～9分(正常肺組織計0分，最嚴重損傷的肺組織計9分)。

1.4 肺組織濕干重比(W/D)測算 切取約1/3新鮮左肺組織，無菌生理鹽水沖洗表面，并用濾紙吸干后，立即稱重，作為濕重(W)；將此塊肺組織放入70 ℃干燥箱內烘烤48 h后，稱重作為干重(D)；計算W/D。

1.5 肺組織活性氧簇(ROS)檢測 采用DHE法。取部分左肺組織，置于液氮凍存后轉移至-80 ℃冰箱保存；取部分凍存的肺組織行冰凍切片，復溫至室溫后，按DHE試劑盒進行操作，熒光顯微鏡觀察肺組織中熒光強度，以平均熒光強度表示大鼠肺組織中ROS水平。

1.6 肺組織MDA、SOD檢測 取部分新鮮左肺組織，制備勻漿，以MDA試劑盒和SOD試劑盒測定，分別用硫代巴比妥酸(TBA)法和水溶性四唑鹽-1(WST-1)法測定MDA和SOD，均按說明書進行操作，兩種指標的結果分別以濃度(nmol/mg)和活性(U/mg)表示。

1.7 肺組織MPO、TNF-α、IL-1β、IL-6檢測 采用免疫熒光法。選取合適的石蠟包埋切片，經脫蠟、水化、孵育、煮片、Ⅰ 抗及Ⅱ抗的結合、胞核染色、封片。暗室下用正置熒光顯微鏡(×400)觀察TNF-α、IL-1β、IL-6、MPO的表達并拍片。使用專業圖像分析軟件 Image Pro Plus 6.0 對結果進行分析和統計。以平均熒光強度表示TNF-α、IL-1β、IL-6的相對表達量，以陽性細胞數表示MPO的相對表達量。

1.8 肺組織NOX2、NOX4檢測 采用免疫組化法。選取合適的石蠟切片，經脫蠟、水化、抗原修復、封閉、一抗孵育過夜、二抗孵育、DAB顯色，復染、脫水、封固后，于正置顯微鏡下(×400)閱片。以組織被染成棕黃色為陽性，使用專業圖像分析軟件Image Pro Plus 6.0對結果進行分析和統計，以積分光密度值(IOD)表示NOX2和NOX4的相對表達量。

2 結果

2.1 各組肺組織病理變化 SO組肺間質及肺泡結構清晰、完整，未見明顯充血、水腫及炎性浸潤；LIRI組肺間質水腫增寬，炎癥細胞浸潤，肺泡毛細血管擴張，肺泡內可見較多紅細胞滲出，損傷明顯；APO組的上述改變減輕(詳見圖1)。

注：A為SO組，B為LIRI組，C為APO組。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化(HE×200)

2.2 各組肺組織W/D、病理學評分比較 肺組織W/D、病理學評分比較見表1。

表1 各組肺組織W/D、病理學評分比較

注：與SO組比較，*P<0.05；與LIRI組比較，#P<0.05。

2.3 各組肺組織ROS平均熒光強度、MDA濃度、SOD活性、MPO陽性細胞數比較 肺組織ROS平均熒光強度、MDA濃度、SOD活性、MPO陽性細胞數比較見表2。

表2 各組肺組織ROS平均熒光強度、MDA濃度、SOD活性、MPO陽性細胞數比較

注：與SO組比較，*P<0.05；與LIRI組比較，#P<0.05。

2.4 各組肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6平均熒光強度比較 肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6平均熒光強度比較見表3。

表3 各組肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6平均熒光強度比較

注：與SO組比較，*P<0.05；與LIRI組比較，#P<0.05。

2.5 各組肺組織NOX2、NOX4蛋白IOD值比較 肺組織NOX2、NOX4蛋白IOD值比較見表4。

表4 各組肺組織NOX2、NOX4蛋白IOD值

注：與SO組比較，*P<0.05；與LIRI組比較，#P<0.05。

3 討論

缺血再灌注損傷(IRI)是器官在缺血基礎上恢復血流后，在再灌注血流帶來的炎癥細胞、炎癥因子及自由基的作用下，組織損傷加重，甚至發生不可逆損傷的現象。肺移植、心肺復蘇和溶栓、介入治療等手術和操作都可引起LIRI[14]。LIRI的臨床表現類似于急性呼吸窘迫綜合征的急性階段，其特征性表現為微血管通透性增加、肺血管阻力增加、肺動脈高壓以及肺水腫形成等[15]。目前，尚無治療措施被證明可以有效預防LIRI，也沒有任何單一治療手段被證明可以治療LIRI，其治療主要包括呼吸機的使用以及液體復蘇等對癥處理[16]。LIRI的機制較為復雜，目前認為LIRI使機體產生有害的氧自由基，導致氧化應激和脂質過氧化，這在LIRI病程中發揮重要作用[17]。

APO是NOX的特異性抑制劑，NOX是體內ROS的重要來源;先前研究表明，APO可減輕小鼠潰瘍性結腸炎中腸道的炎癥反應及氧化應激損傷[8]。在沙鼠腦缺血再灌注模型中，APO可抑制早期IRI中的ROS產生以及由此而導致的神經元損傷[19]；在創傷誘導的大鼠急性肺損傷模型中，APO可以通過降低肺毛細血管通透性及NOX、MPO活性減輕肺損傷[6]；在內毒素誘導的大鼠急性肺損傷模型中，APO可通過減輕氧化應激以及抑制NF-κB、TLR4通路減輕炎癥反應及肺損傷[20]。但目前尚無文獻報道APO在在體肺缺血再灌注模型中的作用。

氧化應激在LIRI中發揮重要作用，ROS是誘發氧化應激反應的重要因素，體內氧化應激水平主要以產生ROS的多少來反應[21]。SOD是體內主要的抗氧化酶和自由基清除劑，其活性高低可反映機體清除氧自由基的能力。MDA是脂質過氧化和組織氧化應激損傷的重要參考指標。MPO不僅是中性粒細胞的功能標志和激活標志，還能間接反應組織氧化應激損傷的程度。在本研究中，LIRI組和APO組中SOD表達均較SO組降低，APO組中SOD較LIRI組升高。MPO和MDA則呈現出與SOD相反的趨勢。上述結果說明LIRI可促進大鼠肺組織氧自由基和活性氧生成，提高中性粒細胞活化水平，導致氧化應激和脂質過氧化，進而導致肺損傷。而APO作為NOX的抑制劑，可降低體內ROS含量，減輕氧化應激和脂質過氧化，進而減輕肺損傷。肺組織濕干比、HE染色和肺病理評分均是反映肺損傷的直觀指標，TNF-α、IL-1β、IL-6等細胞因子可反映組織的炎癥損傷。本研究結果顯示，LIRI組大鼠出現明顯的急性肺損傷改變與炎癥因子升高，而APO組的肺組織干濕比、肺部病理改變、評分及TNF-α、IL-1β、IL-6均較LIRI組出現了不同程度的改善和降低，說明了APO對大鼠LIRI的保護作用。

NOX2又叫gp91phox，是NOX家族的一種，主要在巨噬細胞和中性粒細胞中表達。而NOX4是內皮細胞內ROS的主要來源。NOX由兩種膜蛋白(gp91phox/NOX2和p22phox)和若干種細胞溶質型蛋白(p47phox，p67phox，p40phox和GTP酶Rac1)組成。受到刺激后，上述4種細胞溶質性蛋白轉位至細胞膜，并與上述膜蛋白組裝，進而增加NOX的活性。APO作為一種 NOX 特異性抑制劑，通過在細胞內形成同二聚體diapocynin，抑制上述亞基轉位，進而抑制 NOX 的活化以及ROS形成。NOX是產生ROS的關鍵酶，也是ROS合成的主要來源。IRI時組織內NOX被激活，產生大量ROS，引發氧化應激反應，導致組織氧化損傷。在本研究中，NOX2和NOX4在LIRI組的表達增加，而在APO組表達較LIRI組顯著降低，且ROS與之表達趨勢相同，說明LIRI升高了肺組織氧化應激水平，并促進NOX和ROS的表達，而APO的使用抑制了NOX和ROS的表達。

總之，APO能夠有效預防大鼠LIRI，其機制可能是抑制肺組織NOX2、NOX4蛋白表達。