環(huán)狀RNA circ-Foxo3模擬物轉染對人食管癌細胞株TE-13增殖、凋亡、放射敏感性的影響

邢瑤，查文娟，李曉敏，高飛，劉陽晨

蚌埠醫(yī)學院附屬泰興市人民醫(yī)院，江蘇泰興 225400

食管癌(EC)是全球惡性腫瘤之一，2012年至2016年估計有79萬人死亡[1]。EC的主要組織學類型是食管鱗狀細胞癌(ESCC)，(TE-13細胞則是食管鱗狀細胞株之一)，其中近一半的ESCC病例發(fā)生在中國[2]。叉頭盒O3(FOXO3)是一個轉錄因子，是叉頭家族的成員。環(huán)狀RNA FOXO3(circ-Foxo3)和線性FOXO3(FOXO3 mRNA)均由FOXO3基因編碼[3]。在非小細胞肺癌[4]和乳腺癌[5]中，circ-foxo3的表達較低，為腫瘤抑制基因。此外，一些環(huán)狀RNA有可能成為新的診斷標志物。He等[6]在食管鱗癌組織和細胞系中發(fā)現(xiàn)，circ VRK1表達量是下調的，并發(fā)現(xiàn)在功能上，circVRK1的過度表達抑制了細胞增殖、遷移和上皮間質轉換。circVRK1可能是通過PTEN進行積極調控增加了放射敏感性。然而，circ-Foxo3在食管鱗癌中的具體功能，對放射敏感性的影響及機制，還需要進一步研究。2018年8月～2019年4月，我們選擇食管鱗癌細胞株TE-13作為研究對象，通過控制腫瘤細胞內circ-Foxo3基因的表達，進而觀察其對食管鱗癌細胞株TE-13的生長增殖、凋亡、放射敏感性以及PTEN蛋白表達的影響，尋找抑制食管鱗癌細胞生長的新路徑，旨在為食管鱗癌的放射治療提供新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑 TE-13細胞購自上海中科院細胞庫；RPMI1640購自Gibco公司，TRIzol試劑、RT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，Lipofectamine3000購自美國Invitrogen公司，Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自BD Biosciences公司，過表達circ-Foxo3質粒購自上海吉瑪基因，引物均購自上海生工，CCK-8、0.1%結晶紫、Western blot相關試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 E-13細胞分組、環(huán)狀RNA circ-Foxo3模擬物(circ-Foxo3 mimics)轉染及circ-Foxo3檢測 采用RT-PCR法。將TE-13、HEEPIC細胞株放入RPMI1640培養(yǎng)基(含10%血清)，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞處于對數(shù)生長期，使用Lipofectamine3000將circ-Foxo3 mimics和NC轉染至TE-13細胞中培養(yǎng)(分別計為過表達組、NC組)，用于后續(xù)實驗。轉染前后，用TRIzol試劑提取細胞總RNA，并逆轉錄得到cDNA，操作按試劑盒說明書進行。circ-Foxo3上游引物：5′-GTGGGGAACTTCACTGGTGCTAAG-3′，下游引物：5′-GGGTTGATGATCCACCAAGAGCTCTT-3；U6為內參基因，每個樣品測三個復孔，用2-ΔΔCt分析circ-Foxo3相對表達量。

1.3 TE-13細胞增殖率測算 采用CCK-8實驗。過表達組和NC組以每孔2 000個細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每組設置3個復孔，在0、24、48、72、96 h每孔加入10 μL的CCK-8溶液，孵育3 h，酶標儀檢測450 nm波長處的OD值。

1.4 TE-13細胞凋亡率測算 采用流式細胞術。取過表達組和NC組對數(shù)生長期的細胞，用4 Gy劑量的X線照射后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，胰酶消化收集1×106個細胞，用冰預冷的PBS洗滌重懸細胞，1 000 r/min 離心10 min，棄上清，加入100 μL結合緩沖液，充分重懸后分別加入5 μL膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V FITC)和5 μL碘化丙啶(PI)，混勻后37 ℃下避光孵育20 min，加400 μL結合緩沖液過篩網，流式細胞儀檢測兩組細胞照射前后的細胞凋亡率。

1.5 TE-13細胞放射敏感性測算 采用克隆形成實驗。將過表達組和NC組用胰酶消化，重懸，并在六孔板上分別以200、500、1 000、2 000、5 000/孔鋪板，對應照射劑量為0、2、4、6、8 Gy，每個照射劑量設3個復孔。采用6MV X射線直線加速器從下向上垂直照射細胞，源皮距(SSD)為100 cm。繼續(xù)培養(yǎng)，待六孔板出現(xiàn)肉眼可見的集落時，90%乙醇固定15 min，PBS洗滌，0.1%結晶紫染色20 min，統(tǒng)計細胞個數(shù)≥50的單克隆集落，計算各組細胞克隆形成率(PE)及存活分數(shù)(SF)，PE=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%，SF=受照射組PE/未照射對照組PE×100%。

1.6 TE-13細胞PTEN蛋白檢測 采用Western blotting法。將過表達組和NC組細胞進行4 Gy照射處理，24 h后收集細胞，加入細胞裂解液，冰上裂解30 min后，12 000 r/min離心15 min，將蛋白上清吸取至EP管中，保存于-80 ℃。參照BCA蛋白濃度檢測試劑盒說明書檢測所提蛋白的濃度。將已知濃度的蛋白樣品與5×loading buffer按照4∶1的比例混合后，100 ℃金屬浴煮沸 5 min。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳時，每孔加入50 μg變性蛋白樣品，分離膠用80 V電壓電泳，濃縮膠用120 V電壓電泳，待溴酚藍進入膠的底端邊緣時結束電泳，轉膜至聚氟乙烯(PVDF)膜上，后封閉2 h；洗滌液洗膜3次，每次10 min，與1∶1 000稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜；與稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗常溫孵育1 h。洗滌后滴加化學發(fā)光劑，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析PTEN蛋白的表達水平。

2 結果

2.1 TE-13細胞轉染前后circ-Foxo3相對表達量比較 TE-13細胞轉染前后circ-Foxo3相對表達量分別為0.05±0.01、3.99±0.17，轉染前后比較，P<0.05。

2.2 兩組不同時點OD值比較 不同時點OD值比較見表1。

表1 不同時點兩組OD值比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.3 兩組細胞凋亡率比較 過表達組照射前后細胞凋亡率分別為4.83±0.85、11.67±0.47，NC組分別為0.37±0.06、5.17±0.25，兩組同組照射前后及兩組治療后比較，P均<0.05。

2.4 兩組不同劑量X線照射下細胞存活分數(shù)比較 不同劑量X線照射下細胞存活分數(shù)比較見表2。

表2 不同劑量X線照射下兩組細胞存活分數(shù)比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.5 兩組細胞PTEN蛋白條帶灰度值比較 過表達組照射前后PTEN蛋白條帶灰度值分別為0.71±0.02、0.87±0.01，NC組分別為0.53±0.04、0.55±0.04，兩組同組照射前后及兩組治療后比較，P均<0.05。

3 討論

食管鱗癌是食管癌主要組織學類型，目前食管鱗癌的多種治療(手術、放療、化療、靶向、免疫等)正在迅速發(fā)展，但由于ESCC早期沒有典型的臨床癥狀，確診時多數(shù)已是晚期并有淋巴結轉移，發(fā)病率和復發(fā)率仍然很高，總體5年存活率仍然很低[7,8]。因此，了解食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展機制及相關的基因調控，對食管鱗癌的治療提供新的思路，是目前需要研究的方向。

環(huán)狀RNA在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用已逐漸被發(fā)現(xiàn)，大量文獻顯示可能跟miRNA海綿吸附功能有關，環(huán)狀RNA作為miRNA海綿調節(jié)靶基因的表達[9,10]。此外，環(huán)狀RNA在各種生物體中有豐富的穩(wěn)定性和保守性，由于這種特性，環(huán)狀RNA可能成為潛在的生物標志物[11]。近年來，在競爭的內源 性RNA(ceRNA)網絡的生物學功能中，環(huán)狀RNA發(fā)揮著重要作用[12]。研究顯示，circ-MTO1通過吸附癌基因miR-17抑制肺腺癌的生長，表明circ-MTO1在肺腺癌中起到抑制腫瘤增殖的作用[13]。circ DENND4C是一種與 HIF1α相關的環(huán)狀RNA，在缺氧條件下促進乳腺癌細胞的增殖[14]。研究表明，circ-Foxo3可與ID-1、E2F1、FAK和HIF1相互作用，使它們不能再發(fā)揮抗衰老和抗應激作用，從而增加細胞衰老[15]。Du等[16]在研究circ-Foxo3功能時發(fā)現(xiàn)，circ-Foxo3的表達水平與Foxo3 線性mRNA的表達水平無關，盡管兩者似乎都有抑制腫瘤的活性。目前在人類癌癥中已經注意到circ-Foxo3的失調，但關于circ-Foxo3在食管癌中的生理功能研究尚少。本研究顯示，circ-Foxo3在食管鱗癌細胞中的表達水平較食管正常上皮細胞明顯降低，這說明circ-Foxo3在食管鱗癌中也起著抑癌基因的作用，與circ-Foxo3在其他惡性腫瘤中的研究結果一致。進一步我們發(fā)現(xiàn)，細胞的增殖能力在過表達組較NC組明顯被抑制，而細胞凋亡數(shù)明顯增加，提示circ-Foxo3可能與了食管鱗細胞的增殖、凋亡能力有關。

1997年首次在膠質瘤細胞中發(fā)現(xiàn)了PTEN基因[17]，后進一步研究發(fā)現(xiàn)PTEN參與了細胞內多數(shù)信號傳導通路[18]，并影響了細胞增殖、凋亡。PTEN作為miR-106b 的直接靶基因，在一定程度上誘導了細胞放射抵抗[19]。上調PTEN蛋白水平可以抑制腫瘤細胞增殖并且誘導食管癌細胞凋亡和細胞周期阻滯，而PTEN的表達水平與腫瘤放療療效顯著相關[20]。本研究結果顯示，經過X射線照射后，過表達組細胞存活率較NC組降低，細胞凋亡數(shù)及PTEN蛋白表達水平較NC組升高。

總之，circ-Foxo3在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著抑癌基因的作用，過表達circ-Foxo3可能抑制細胞增殖，促進凋亡，增加了細胞對放射的敏感性，其可能的機制跟PTEN基因表達上調有關。