不同濃度三七總皂苷對人淋巴瘤Raji細胞系增殖、凋亡的影響及其機制探討

李泉，王占聚，孟潔，高文風，王愛紅，陳蕾

濰坊醫學院附屬醫院，山東濰坊 261031

淋巴瘤(NHL)是常見的血液系統惡性腫瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，近年發病呈逐漸上升的趨勢，傳統的治療方案不能獲得滿意的治療效果，目前迫切需要新的治療策略[1,2]。三七總皂苷(PNS)是中藥五加科人參屬植物三七的主要成分，含有多種單體皂苷，具有擴血管、降低心肌耗氧量、抗炎以及抗氧化等作用[3,4]。近年來，PNS的抗腫瘤作用備受關注，有研究證實其可抑制肝癌、直腸癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞增殖，然而有關PNS對NHL細胞的影響報道較少。2018年1月～2019年2月，我們選用Raji細胞系為研究對象，探討不同劑量PNS對腫瘤細胞增殖、凋亡等方面的影響，并檢測VEGF以及PI3K-AKT-mTOR信號通路的變化是否為其可能機制，以期為NHL的治療提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 細胞系、試劑 人NHL Raji細胞系購于中國科學院上海細胞研究所。PNS購自南京澤朗醫藥科技有限公司；DMEM培養基、胎牛血清、雙抗購自Invitrogen公司；MTT試劑盒、Annexin-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自上海生工生物工程公司；總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司，引物由上海賽百盛生物公司合成；PI3K-p85、p-AKT、p-mTOR、β-actin以及HRP標記的二抗購自CST公司；蛋白裂解液、脫脂奶粉、BCA蛋白檢測試劑盒以及顯色試劑盒購自碧云天生物科技公司。

1.2 Raji細胞系培養、分組及PNS干預方法 Raji細胞系培養于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素DMEM培養液中，在37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養。選擇處于對數生長期的細胞，并將細胞分為PNS低、中、高濃度組及陰性對照組，PNS低、中、高濃度組分別加入終濃度為100、200、400 μg/mL的PNS溶液，陰性對照組加入細胞培養液。

1.3 Raji細胞系增殖抑制率測算方法 采用MTT法。將細胞以1×104/孔的密度接種于96孔板中(200 μL/孔)，不同濃度PNS作用24、48、72 h，后每孔中加入20 μL的MTT(5 mg/mL)，孵育4 h后棄去上清液，加入200 μL的DMSO，酶標儀測量570 nm處吸光度(OD)值。計算細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%，其中PNS低、中、高濃度組為實驗組，陰性對照組設定對照組。

1.4 Raji細胞系凋亡率測算方法 采用流式細胞技術。正常條件下孵育細胞，不同濃度PNS作用作用24、48、72 h，后收集細胞，PBS輕洗3次后以195 μL Binding Buffer重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC試劑，4 ℃避光孵育30 min，離心棄上清，加入190 μL Binding Buffer重懸細胞，加入10 μL PI混勻，4 ℃避光孵育5 min，1 h內送檢分析，采用Cell Quest軟件分析細胞凋亡數據。

1.5 Raji細胞系VEGF mRNA檢測方法 采用實時熒光定量PCR法。不同濃度PNS作用24、48、72 h后，TRIzol法抽提總RNA，按逆轉錄試劑盒說明制備cDNA，以cDNA為模板，β-actin為內參進行擴增。反應體系：2×SYBR Premix ExTaqTM12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O補足體積至25 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s，94 ℃、30 s，50 ℃、30 s，72 ℃、45 s，共30個循環，反應結束后再72 ℃延伸10 min。擴增結束后分析擴增曲線、熔解曲線和CT值，將待測基因以及內參β-actin的Ct值代入公式2-ΔΔCt公式進行計算，分析待測基因的相對表達水平。引物序列：VEGF上游引物5′-AGGGCAGAATCATCACGAAGT-3′，下游引物5′-AGGGTCTCGATTGGATGGCA-3′；β-actin上游引物5′-CCTAGAAGCATTTGCGGTGG-3′，下游引物5′-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3′。

1.6 Raji細胞系PI3K-AKT-mTOR蛋白檢測方法 采用Western blotting法。不同濃度PNS作用48 h后收集細胞，提取細胞蛋白并測定蛋白濃度。細胞蛋白經SDS-PAGE分離，轉移至硝酸纖維素膜上，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入PI3K-p85(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000)以及p-mTOR(1∶1 000)抗體4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后加入HRP標記的二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h，TPST洗膜3次，ECL化學發光法顯影、定影后將膠片拍照，以β-actin作內參照，Bio-Rad成像分析軟件計算目的蛋白灰度比值，分析細胞信號通路的變化。

2 結果

2.1 不同時點各組細胞增殖抑制率比較 不同時點細胞增殖抑制率比較見表1。

表1 不同時點各組細胞增殖抑制率比較

注：與PNS低濃度組比較，aP<0.05；與PNS中濃度組比較，bP<0.05；與同組24 h比較，cP<0.05；與同組48 h比較，dP<0.05。

2.2 不同時點各組細胞凋亡率比較 不同時點細胞凋亡率見表2。

表2 不同時點各組細胞凋亡率比較

注：與PNS低濃度組比較，aP<0.05；與PNS中濃度組比較，bP<0.05；與同組24 h比較，cP<0.05；與同組48 h比較，dP<0.05。

2.3 不同時點各組VEGF mRNA相對表達量比較 不同時點VEGF mRNA相對表達量比較見表3。

表3 不同時點各組VEGF mRNA相對表達量比較

注：與PNS低濃度組比較，aP<0.05；與PNS中濃度組比較，bP<0.05；與同組24 h比較，cP<0.05；與同組48 h比較，dP<0.05。

2.4 藥物作用48 h各組PI3K-AKT-mTOR蛋白相對表達量比較 藥物作用48 h PI3K-AKT-mTOR蛋白相對表達量比較見表4。

表4 藥物作用48 h各組PI3K-AKT-mTOR蛋白相對表達量比較

注：與PNS低濃度組比較，aP<0.05；與PNS中濃度組比較，bP<0.05。

3 討論

NHL是一種常見的血液系統惡性腫瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，臨床主要表現為無痛性淋巴結腫大、肝脾腫大等，全身各組織器官均可受累[2]。目前，NHL的治療以化療方案為主，環磷酰胺、柔紅霉素、長春新堿和潑尼松組成了經典的CHOP化療方案[5]。近年來，新型方案不斷出現，如利妥昔單抗可有效提高NHL患者的緩解率。Galiximab(抗CD80抗體)單用或與利妥昔單抗聯合應用可對各種NHL細胞具有顯著的抗腫瘤活性[6]。蛋白酶體抑制劑和免疫調節藥物如硼替佐米和來那度胺，已經證實在NHL的治療中具有良好療效。但上述治療策略均存在不足，部分患者對治療方案無反應或接受治療后復發，因此尋找新的NHL治療策略成為當務之急。Raji細胞系即NHL細胞，也稱黑人Burkitt淋巴瘤細胞，是常用于基礎研究的NHL細胞[7]。

PNS是從中藥三七中提取出的一組有效成分，具有活血祛淤、通脈止血、保護脊髓、視神經及心腦缺血性損傷等作用，在臨床中得到廣泛的應用[8]。研究證實，PNS可以通過抗炎和免疫調節的途徑發揮抗動脈粥樣硬化的作用[9]。有學者應用PNS治療慢性阻塞性肺病以及肝纖維化等疾病，均取得良好的效果[10,11]。近年來，有關PNS抗腫瘤作用備受關注，有研究證實其可通過直接殺傷腫瘤細胞、抑制腫瘤細胞生長、誘導腫瘤細胞凋亡、逆轉腫瘤細胞的耐藥性、促進細胞自噬、增強機體免疫功能等多種方式起到抗腫瘤作用[3,12,13]，目前已證實PNS可明顯抑制宮頸癌、乳腺癌以及結直腸癌等腫瘤細胞的增殖[14,15]。然而有關PNS治療NHL方面的報道較少，尤其是涉及PNS抗腫瘤的具體分子機制目前尚不明確。本文結果顯示，PNS能顯著抑制體外培養Raji細胞系增殖，且具有濃度和時間依賴性，隨著PNS濃度增加及作用時間延長，Raji細胞系增殖抑制率也明顯增高；PNS可促進Raji細胞系凋亡，且隨著作用濃度和作用時間的增加，細胞凋亡率顯著升高。上述結果證實，PNS可抑制Raji細胞系增殖并促進其凋亡，提示PNS對NHL可能具有一定治療作用。

本研究進一步檢測了PNS作用后NHL細胞VEGF、PI3K-p85、p-AKT、p-mTOR變化。VEGF是一種重要的多功能血管生成因子，具有強大的促血管內皮細胞增殖作用，可通過刺激毛細血管增生而促進腫瘤細胞的生長與轉移，其表達活性與腫瘤的發展與發展有密切關系[16,17]。有研究[18]表明，VEGF在NHL Raji細胞系中呈高表達現象并在炎癥因子TNF-α的輔助下促進腫瘤的發展。PI3K-p85、p-AKT以及p-mTOR均為PI3K-AKT-mTOR信號通路蛋白，此通路廣泛存在于各種真核細胞內，在腫瘤細胞中多呈高度活化狀態，可通過磷酸化多種底物而促進腫瘤細胞增殖[19～21]。有學者證實，PI3K-AKT-mTOR信號通路在NHL中存在異常活化的情況[22]，通過特異性信號通路抑制劑抑制此通路活性，可抑制NHL的發展[23,24]。有研究[14,25]證實，PI3K-AKT-mTOR信號通路可通過VEGF促使腫瘤微血管形成并促進腫瘤的生長和轉移。本文結果證實，PNS作用于Raji細胞系后，細胞內VEGF mRNA表達水平以及PI3K-p85、p-AKT、p-mTOR蛋白活性均顯著下降，提示PNS可能通過PI3K-AKT-mTOR信號通路抑制VEGF表達抑制NHL的發展。

總之，PNS能抑制NHL Raji細胞系的增殖，并誘導其發生細胞凋亡，機制可能與其可通過PI3K-AKT-mTOR信號通路抑制VEGF表達而完成，其在NHL治療中具有一定的應用前景，值得進一步深入研究。