著絲粒蛋白K小干擾RNA轉染對人肺癌細胞系A549增殖、遷移和侵襲能力的影響

葉俠，周琳，吳杰，陶敏

蘇州大學附屬第一醫院，江蘇蘇州 215000

肺癌是世界上最常見的癌癥死亡原因之一，占癌癥死亡人數的1/4[1];據估計，全世界每年約有22.25萬新病例確診，肺癌患者5年生存率僅為18%[1]。在所有肺癌類型中，非小細胞肺癌約占85%，小細胞肺癌僅占15%[2]。肺癌的發生發展是多因素參與的機制復雜的過程[3,4]，因此發現早期標志物，識別更多靶點，對于肺癌患者個體化治療以及進一步了解肺癌發生發展機制至關重要。20世紀末，在Fritzler和Moroi的共同努力下，人們首次在硬皮病患者的血漿中發現了著絲粒蛋白[5]，并注意到它們能結合在著絲粒DNA上，兩者組成的動粒在染色體分離和有絲分裂過程中起著關鍵作用,但是關于著絲粒蛋白K(CENPK)在肺癌中的研究較少。2019年4～10月，我們通過小干擾RNA(siRNA)使CENPK的表達下調，觀察si-CENPK轉染對人肺癌細胞系A549增殖、遷移和侵襲能力的影響，旨在為肺癌的治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 人肺癌細胞系A549及人源正常支氣管上皮細胞系細胞系HBE購自American Type Culture Collection(ATCC)。Lipofectamine 2000轉染試劑、Transwell小室從美國Invitrogen 公司購買；RNA抽提試劑盒及2×SYBR green PCR master mix均購自日本Takara公司；逆轉錄試劑盒購自Fermentas公司；siRNA-CENPK小干擾RNA及其陰性對照siRNA-NC由廣東市銳博科技有限公司設計合成；q-RTPCR引物由上海生工生物有限公司合成；CCK8購自中國Biosharp公司。細胞培養皿、六孔板均購自美國Coring公司；超凈工作臺購自美國Airtech公司；恒溫水浴箱購自蘇州伯西瓦爾公司；二氧化碳細胞培養箱、全自動酶標儀均購自美國Thermo公司；LighterCycle96實時熒光定量PCR儀購自瑞士Roche公司；熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 A549、HBE細胞中CENPK mRNA檢測方法 采用q-RTPCR法。收集組細胞并按照Taraka試劑盒步驟提取RNA.濃度和純度合格后，將提取的RNA逆轉錄為cDNA并進行PCR擴增。采用2-ΔΔCt法計算CENPK mRNA相對水平。實驗重復3次，以平均值作為最終結果。

1.3 A549細胞培養、分組及si-CENPK轉染 將A549細胞培養于含10%FBS、100 U/mL雙抗的RPMI1640培養基中，并置于37 ℃、5%CO2培養箱常規培養，當細胞融合度達90%時，0.25%胰酶(含EDTA)消化，1∶2傳代。取傳3～6代，生長狀態良好的處于對數生長的A549細胞。轉染前1 d將A549細胞系接種于6孔板中，隨機分為si-CENPK實驗組、si-NC陰性對照組、空白對照組。si-CENPK實驗組轉染si-CENPK，si-NC陰性對照組轉染si-NC，空白對照組不予轉染，每孔約2×105個細胞，每組設置3個復孔。當細胞融合度約為60%時將含雙抗及血清的培養基更換為無血清、無雙抗的1640培養基，各轉染質粒瞬時離心后按說明加入250 μL的RNase-free水稀釋,配制成儲存液，-20 ℃保存(儲存濃度為20 mol/L)。各用500 μL不含血清的Opti-MEM 培養液分別稀釋5 μL轉染質粒與5 μL的Lipofectamine2000，輕輕混勻，室溫孵育5 min，再將兩者混合輕輕吹打混勻，室溫放置15 min并將混合液加到含1 mL無血清細胞培養基中。轉染6 h后加含10%FBS、100 U/mL的培養基2 mL繼續培養，24 h后棄去舊培養基并重新加入含10%FBS的1640培養基2 mL于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱繼續培養，48 h后收集各組轉染細胞便于后續實驗。

1.4 轉染后的A549細胞CENPK mRNA檢測方法 采用q-RTPCR法。收集3組細胞并按照Taraka試劑盒操作流程提取RNA，經Nanodrop1000分光光度計分析，OD260/OD280為1.8～2.0，即提取的RNA濃度和純度合格。按逆轉錄試劑盒操作說明將提取RNA逆轉錄為cDNA。按SYBRGreen說明進行PCR擴增，模板為cDNA。PCR反應體系10 μL：2×SYBRGreen 5 μL，Forward Primer 0.3 μL，Reverse Primer 0.3 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.4 μL；反應條件：95 ℃、10 min，94 ℃、20 s，60 ℃、60 s，40個循環。以actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算CENPK相對水平。實驗重復3次，以平均值作為最終結果。引物序列：CENPK上游引物5′-GAAACACTCAC-CGATTCAAATG-3′，下游引物5′-GCTTTTGGAACTC-TTCTTTTCC-3′；actin上游引物5′-CTGGACTTCGAGCAAGAGATG-3′，下游引物5′-CTGGACTTCGAGCAAGAGATG-3′。

1.5 轉染后的A549細胞OD值測算方法 采用CCK8檢測法。收集各組轉染48 h細胞，0.25%Trypsin(含EDTA)消化，10%FBS的完全培養基重懸制成單細胞懸液，在96孔板中加入適量細胞懸液，每孔100 μL，每孔2×103個細胞，置于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養。分別在培養24、48、72、96 h，每孔加入CCK-8，總量為10 μL，37 ℃培養箱孵育1 h，用酶標儀檢測各孔450 nm波長處的OD值，每組設置3個復孔，實驗重復3次，取平均值。

1.6 轉染后的A549細胞細胞間距離測算方法 采用細胞劃痕實驗。預先準備材料marker筆，6孔板及直尺。直尺與6孔板水平方向平行，在6孔板背后，均勻劃橫線，間隔0.5～1 cm。收集各組轉染48 h細胞制成單細胞懸液，6孔板中加入適量細胞懸液，于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中常規培養以第2天融合率100%為宜，用200 μL滅菌槍頭垂直孔板底部劃直線，每孔約5～6條直線，盡量與在背面劃的橫線垂直。用PBS沖洗各孔細胞2遍，動作輕柔，目的去除細胞碎片及脫落細胞。加入2 mL無血清培養基37 ℃、5%CO2的培養箱中繼續培養。分別于劃痕后0、48 h在顯微鏡下觀察細胞遷移情況并選擇合適視野及放大倍數拍照。使用Image J軟件打開圖片后，計算各組細胞間距離的均值。細胞遷移能力用各組細胞距離均值表示。實驗重復3次，取平均值。

1.7 轉染后的A549細胞穿膜細胞數測算方法 采用Transwell侵襲實驗。Transwell上室中加入1∶6(基質膠∶DMEM)稀釋后的基質膠50 μL，37 ℃、30 min使其凝固。收集各組轉染48 h細胞，0.25%胰蛋白酶消化離心，所得沉淀使用無血清RPMI1640培養基重懸并稀釋至1×106/mL，從中吸取100 μL細胞懸液加入到Transwell上室，注意不要有氣泡產生，并在下室內加入600 μL含有10%FBS的完全培養基，培養箱常規培養。24 h后取出培養板，吸棄上室內培養基，Transwell小室上層用棉簽拭去，動作輕柔，防止未遷移的細胞和Matrigel基質膠殘留，PBS沖洗2遍后使用甲醛固定，PBS再沖洗2遍后使用甲紫染色，倒置，晾干，在光學顯微鏡下觀察細胞是否穿膜及穿膜情況，拍照并隨機選取3個不同高倍視野進行細胞數統計，計數穿膜細胞數。以不同視野下穿膜細胞數平均值的多少作為細胞侵襲能力強弱的標準。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 A549細胞、HBE細胞中CENPK mRNA相對表達量比較 A549細胞、HBE細胞中CENPK mRNA相對表達量分別為2.710±0.153、1.000，兩者比較，P均<0.05。

2.2 各組CENPK mRNA相對表達量比較 si-CENPK實驗組、si-NC陰性對照組、空白對照組CENPK mRNA相對表達量分別為0.28±0.06、1.12±0.10、1.000，si-CENPK實驗組與其他兩組比較，P<0.05。

2.3 轉染后24、48、72、96 h各組OD值比較 轉染后24、48、72、96 h OD值比較見表1。

表1 轉染后24、48、72、96 h各組OD值比較

注：與其余兩組比較，*P<0.05。

2.4 各組轉染48 h細胞間距離比較 si-CENPK實驗組、si-NC陰性對照組、空白對照組轉染48 h細胞間距離分別為(0.70±0.02)、(0.34±0.03)、(0.37±0.06)cm，si-CENPK實驗組、si-NC陰性對照組比較，P<0.05。

2.5 各組轉染48 h穿膜細胞數比較 si-CENPK實驗組、si-NC陰性對照組、空白對照組轉染48 h穿膜細胞數分別為(89±10)、(163±12)、(168±11)個，si-CENPK實驗組與其他兩組比較，P均<0.05。

3 討論

肺癌是一種有多種亞型組成異質性疾病，在所有惡性腫瘤中其病死率較高，具有獨特的生物學和臨床特征。目前，臨床上治療肺癌的方法主要有手術、放療、化療、靶向治療以及免疫治療等[6,7]，但近年來化療耐藥性的增加、靶向治療的抵抗和遠處轉移[8～10]，使肺癌的治療效果更差。因此，尋找新的生物標志物，為患者發現有效的個體化治療方法，是一項具有挑戰性且有意義的工作[11,12]。肺癌細胞系A549是1972年由Giard DJ從一位58歲男性通過肺癌組織移植培養建立的，有研究[3]報道指出CENPK在肺癌細胞系A549中高表達，但是對該細胞系具體的生物學行為卻未見報道。

近年來，著絲粒蛋白的研究取得了重大成就，很多研究闡明了它們在癌癥中的作用[13～15]。CENP家族蛋白是著絲粒蛋白的主要部分。著絲粒是染色體區域的一部分，可以使有絲分裂動粒聚集，以確保正確的染色體附著到微管上，并使姐妹染色單體分離[16]。著絲粒由超過80種不同的蛋白質組成。許多蛋白質在真核生物中是保守的。在細胞分裂過程中著絲粒蛋白附著在染色單體上，將姐妹染色單體分開。染色體異常分離和著絲粒檢查點蛋白缺陷定位可以導致非整倍體和染色體不穩定，而非整倍體和染色體不穩定已經被確定為大多數實體腫瘤的標志，在很多癌癥中都能觀察到這種現象。CENPK又名AF5alpha、P33、ICEN37、FKSG14及Solt，位于染色體5q12.3，著絲粒的外層，有5個轉錄本，19個外顯子，分子量為31 kD，共269個氨基酸，是CENPH/I著絲粒復合體相關的亞單位，靶標是CENPA，具有維持適當的動粒功能和促進有絲分裂進展的功能，廣泛存在于卵巢和骨髓中。有研究報道，CENPK在卵巢癌中高表達且與不良預后相關，促癌作用明確同時與CA125及HE4連用可以提高診斷卵巢癌的靈敏性[3]。也有文獻報道，下調CENPK的表達能通過使癌細胞停留在G0/G1期從而抑制三陰性乳腺癌的增殖能力。最新的報道指出，CENPK在肝癌細胞及組織中表達升高，CENPK的表達降低可以通過抑制YAP1抑制肝癌細胞惡性生物學行為從而抑制肝癌的進展，Liu等報道也指出CENPK在膀胱癌中高表達并且可能參與膀胱癌的發生發展，但目前關于CENPK表達與肺癌細胞惡性生物學行為的報道較少。為明確CENPK在肺癌中的生物學功能，我們體外培養A549細胞及HBE，并將A549細胞轉染si-CENPK使其CENPK表達下調，進一步通過劃痕實驗、CCK8實驗、侵襲實驗研究，發現與正常支氣管上皮細胞HBE相比，CENPK在肺癌細胞中高表達；si-CENPK實驗組中CENPK mRNA相對表達量明顯低于其他兩組；si-CENPK實驗組細胞增殖遷移和侵襲能力明顯低于其他兩組。這表明CENPK在肺癌中發揮促癌基因樣作用明確，但目前CENPK下調抑制肺癌細胞增殖遷移和侵襲能力的機制尚不完全清楚，有待于進一步研究。

總之，si-CENPK轉染能夠抑制A549細胞增殖、遷移和侵襲能力。