四種復(fù)合生物制劑對鯽魚生長和免疫功能的影響

趙 碩，梁晶晶， 劉寶同， 王永慶，李永生

（青島根源生物集團集團有限公司，山東青島 266111）

2018年全國水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量為4991.06萬噸，同比增長1.73%（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局，2019），伴隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量的增加，養(yǎng)殖污染及用水緊缺問題不斷加劇，在養(yǎng)殖過程中使用微生態(tài)制劑和酶制劑是提高飼料利用率、抑制有害菌、改善水體環(huán)境的重要手段之一。研究表明，微生態(tài)制劑和酶制劑在有效劑量下持續(xù)使用會改善腸道及生長環(huán)境，降低不良環(huán)境下動物的應(yīng)激和疾病發(fā)生率（鞠安琪等，2018；郭正富等，2018；楊鏗等，2016）。但這兩種制劑在添加到飼料時，多要經(jīng)過調(diào)制、制粒過程，這期間，活菌和酶蛋白會經(jīng)受高溫、高濕和高壓的過程。為解決這一添加難題，可單獨將菌、酶添加載體和黏合劑制成魚類可攝食的顆粒，按一定比例添入成品飼料中，避免飼料加工過程對菌、酶有效成分的影響。本文將4種復(fù)合生物制劑通過冷制粒制成1.5 mm的顆粒，按5%的比例與商品飼料同時投喂，研究其對鯽魚生長性能及血清免疫、抗氧化和理化指標的影響，以期為生物制劑在鯽魚養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 飼料制備 試驗所用基礎(chǔ)日糧為山東某飼料有限公司1.5 mm沉水鯽魚顆粒料，將Ⅰ-Ⅳ四種復(fù)合生物制劑以發(fā)酵麩皮和面粉為載體采用濕法冷制粒工藝制成顆粒，粒徑1.5 mm，在基礎(chǔ)日糧中分別添加5%。四種復(fù)合生物制劑的主要成分見表1。

表1 四種復(fù)合生物制劑主要成分

1.2 試驗動物 試驗用鯽魚于2018年10月購自青島市即墨王圈水庫，規(guī)格為100～150尾/kg。購回后在室內(nèi)水族箱循環(huán)水系統(tǒng)暫養(yǎng)馴化一周，水溫（27±2）℃，采用電磁式空氣泵連續(xù)充氣、直流變頻水泵進行循環(huán)，流量12000 L/h，每個水族箱長 39 cm、寬 39 cm、高 33 cm，有效水體 50 L，全系統(tǒng)32個水族箱，3 h完成一次循環(huán)。

1.3 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理 試驗選取（8.0±1.0）g/尾的鯽魚120尾，分為5組，每組4個水族箱，每個水族箱6尾，分組情況如表2所示。投餌量按體重3%～4%投喂，每日投喂三餐，投喂時間為8:30、12:30、16:30，每餐少量多次投喂。2018年11月1日正式開展試驗，養(yǎng)殖試驗為期45 d。水族箱頂鋪蓋紗網(wǎng)以防止鯽魚跳出。日常水質(zhì)保持以下指標：淡水、pH 8.0±0.4、氨氮≤0.2 mg/L，亞硝酸鹽≤0.05 mg/L，水溫26～28℃，溶氧≥4 mg/L。每天換水10%，換水過程中溫度上下波動不超過3℃。如氨氮、亞硝超標，適當增加換水量。

表2 試驗分組及設(shè)計

1.4 試驗指標

1.4.1 健康狀況 試驗結(jié)束，每箱取2尾鯽魚進行解剖，測量體長、腸道長度，觀察腸道韌性和肝臟、膽、腎臟及性腺發(fā)育情況。

1.4.2 糞便中異養(yǎng)細菌數(shù)量 試驗后期，分別收集A組和E組鯽魚糞便，2000 r/min離心5 min，棄去上清，留下糞泥備用。稱取1 g糞泥，重懸于100 mL無菌水中，搖床振蕩30 min，做成10-2懸液，取一部分懸液于試管中，75℃水浴20 min。采用營養(yǎng)瓊脂涂布法分別測定A組和E組糞便中水浴前后的異養(yǎng)細菌含量。

1.4.3 生長指標 養(yǎng)殖初始和結(jié)束，逐一對水族箱中鯽魚進行計數(shù)和稱重，計算增重率、特定生長率、餌料系數(shù)及成活率。

增重率（WGR）/%=[（Wt-W0）/W0]×100；

餌料系數(shù)（FCR）=F/（ Wt-W0）；

成活率（SR）/%=T活/T總×100；

式中：W0為初始平均體重，g；Wt為結(jié)束平均體重，g；F 為攝食量（投喂量-殘餌量），g；T活為結(jié)束時成活尾數(shù)，T總為開始時總尾數(shù)。

1.4.4 血清免疫、抗氧化和理化指標 飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，每個水族箱取2尾鯽魚，在低溫下尾靜脈采血，采用超低溫離心機12000 r/min離心10 min，取上清液測定堿性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶 （SOD）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶 （GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT），均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒并參照試劑盒說明書進行操作。

1.4.5 CCl4攻毒試驗 養(yǎng)殖結(jié)束后，剩余鯽魚停食一天，均按0.5 mL/10 g體重進行腹腔注射50%濃度CCl4（經(jīng)橄欖油稀釋），注射后第2天開始繼續(xù)投喂對應(yīng)基礎(chǔ)飼料與生物制劑，每天記錄各組死亡情況，并分別在第7天和第14天取4尾魚尾靜脈采血，采用超低溫離心機12000 r/min離心10 min，取上清液測定血清GOT酶活。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析 試驗結(jié)果以 “平均值±標準誤”表示，試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件單因素方差分析和Duncan’s多重比較檢驗，以P＜0.05作為差異顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 成活率與解剖觀察 45 d養(yǎng)殖期間鯽魚健康狀態(tài)良好，所有處理組成活率均為100%。試驗結(jié)束時，通過解剖對每組鯽魚內(nèi)臟健康狀況進行觀察，結(jié)果顯示腸道韌性良好，肝臟偶見花肝和土黃色，多數(shù)顏色正常，各組之間無顯著性差異；膽略大，可能與稱重前提前饑餓24 h有關(guān)；腎臟正常。此外，對腸道與體長比例進行了分析，C和D兩組腸體比有增加趨勢，E組有降低趨勢（圖1），推測與C組添加大量的丁酸梭菌以及D組添加了適量的綠原酸等植物提取物有關(guān)。

2.2 糞便中異養(yǎng)細菌數(shù)量 試驗期間對A、E兩組鯽魚糞便中的異養(yǎng)細菌進行了檢測。結(jié)果表明，只投喂基礎(chǔ)日糧的鯽魚糞便中異養(yǎng)細菌含量為5.4×108cfu/g，其中芽孢數(shù)量為 4.4×106cfu/g。而投喂了添加生物制劑后，糞便中異養(yǎng)細菌含量為1.5×109cfu/g，其中芽孢為 5.0×107cfu/g，說明飼喂復(fù)合生物制劑后其會在魚腸道中大量繁殖，排出的糞便含有大量繁殖后的芽孢桿菌營養(yǎng)體，此外還含有少量未萌發(fā)的芽孢，數(shù)量均遠遠高于只投喂飼料的對照組（P＜0.05），其中糞便中異養(yǎng)菌的含量比對照組提高了2.7倍，芽孢的含量比對照組提高了11.4倍。

2.3 生長性能 由表3可知，B組和E組鯽魚增重率分別比對照組提高6.5%和9.5%；餌料系數(shù)分別比對照組降低11.0%和6.9%。通過不同生長周期的增重率數(shù)據(jù)分析可知，在投喂相應(yīng)的生物制劑15 d后B組和E組增重率均已高于其他組別，30～45 d這種優(yōu)勢一直保持（表4）。

表3 鯽魚生長性能檢測結(jié)果

表4 鯽魚不同養(yǎng)殖時間增重率%

2.4 血清免疫、抗氧化和理化指標 由圖2～5可知，C組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶含量均低于對照組（P≥0.05），B組兩者均高于對照組，而C、D兩組兩種指標與對照組相比趨勢不一致，整體組間差異不顯著（P≥0.05）。E組血清堿性磷酸酶和超氧化物歧化酶含量均高于對照組（P＜0.05），堿性磷酸酶和超氧化物歧化酶分別比對照組提高了16.3%和24.1%，D組與對照組均值相當，B、C兩組兩種指標與對照組相比趨勢不一致，整體組間差異不顯著（P≥0.05）。

2.5 CCl4攻毒試驗 養(yǎng)殖45 d后采用CCl4進行攻毒顯示，這種攻毒方式鯽魚死亡率整體較低，15 d累計死亡率對照組為 （28.33±8.25）%，B、C組 15 d未出現(xiàn)死亡，D、E組分別為（10.00±7.02）%和（16.7±11.79）%。 但血清谷草轉(zhuǎn)氨酶的測定結(jié)果顯示，CCl4攻毒會引起其含量變化，前期飼喂不同的生物制劑，對攻毒后谷草轉(zhuǎn)氨酶的變化趨勢有影響。攻毒7 d和14 d后對照組和D組谷草轉(zhuǎn)氨酶均呈降低趨勢，B、C、E三組先升高后降低。試驗結(jié)束時4個試驗組均低于對照組（圖 6）。

3 討論

多種益生菌、酶制劑和植物提取物復(fù)配而成的生物制劑，經(jīng)低溫制粒后在養(yǎng)殖中使用，通過檢測糞便中異養(yǎng)細菌的數(shù)量顯示，飼料中添加生物制劑后可顯著增加腸道異養(yǎng)菌數(shù)量。增重率和餌料系數(shù)結(jié)果顯示，飼喂顆粒復(fù)合生物制劑后飼料利用率提高、生長性能改善。所有組別在一個養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)，養(yǎng)殖全程未發(fā)生病害，包括對照組和投喂生物制劑組內(nèi)臟各器官均處于健康狀態(tài)。

對益生菌、酶制劑和植物提取物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用已有較多研究，表明這3類生物制劑對水產(chǎn)動物的生長和免疫都有一定改善作用 （王明陽等，2018；李軍濤等，2018；劉夢等，2017；張麗等，2017；張耀武等，2008）。但將多種益生菌、酶制劑與植物提取物復(fù)合后在鯽魚中的應(yīng)用鮮有報道。本研究中對包括生長、餌料系數(shù)、血清理化、抗氧化和免疫等指標的檢測結(jié)果顯示，E組表現(xiàn)最佳，其使用的復(fù)合生物制劑Ⅳ主要組分包括木聚糖酶、中性蛋白酶等6種單酶（部分固體發(fā)酵復(fù)合酶），凝結(jié)芽孢桿菌、丁酸梭菌等8種益生菌，并添加了綠原酸、杜仲多糖等復(fù)合植物提取物。相較而言，B組未添加植物提取物，益生菌和酶制劑組分與E組相同，使用后效果略差于E組，但兩組均優(yōu)于對照組和其他兩個復(fù)合制劑組。

肝臟是魚體內(nèi)最大的實質(zhì)性器官，其功能很強大，對來自體內(nèi)外的許多非營養(yǎng)性物質(zhì)，如各種藥物、毒物以及體內(nèi)某些代謝產(chǎn)物等有生物轉(zhuǎn)化作用，具有很好的解毒功能和代謝功能，因此，肝臟更容易受到外環(huán)境、病毒、細菌等因素的影響。四氯化碳（CCl4）是經(jīng)典的肝損傷誘導(dǎo)劑（劉英娟等，2015；何秋霞等，2012）。本研究中采用 CCl4攻毒，嘗試探索飼喂復(fù)合生物制劑后對肝臟損傷的保護作用，結(jié)果表明，飼喂不同的復(fù)合生物制劑后對CCl4損傷有明顯保護作用。在目前的高密度養(yǎng)殖中使用此類制劑，可起到減輕魚類消化道和肝臟負擔、改善機體內(nèi)環(huán)境以及水體外環(huán)境的綜合作用，在抗生素替代中具有廣闊的應(yīng)用前景。試驗中四氯化碳致死毒性不高，此外，CCl4對魚體注射處局部有一定腐蝕作用，是后期研究中采用此法進行肝臟攻毒試驗應(yīng)注意的事項。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，在飼料中添加復(fù)合生物制劑可改善鯽魚的生長性能、免疫功能和抗氧化能力，并且對CCl4攻毒后的肝臟有明顯的保護作用，本研究中以復(fù)合生物制劑Ⅳ效果最佳。