大理彌渡熱泉耐熱脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選及其酶活性研究

桑 鵬 ，劉林波 ， 陳貴元 ，楊力權(quán) *

（1.大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理671003；2.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理671000；3.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，云南大理671000）

脂肪酶全稱為酰基甘油水解酶，廣泛分布于動物、植物和微生物體內(nèi)，其中以微生物類脂肪酶居多。研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)脂肪酶的微生物有：熒光假單胞菌、黑曲霉菌、根霉菌、毛霉圓柱假絲酵母菌、圓弧青霉粘質(zhì)色桿菌和枯草桿菌（陳雄金等，2008）。脂肪酶可以催化脂水解、酯交換、酯合成等反應(yīng)，因而在食品、化妝品、皮革、生物柴油等領(lǐng)域均具有廣泛的應(yīng)用。

耐熱脂肪酶和普通脂肪酶相比具有耐高溫的特點。耐熱脂肪酶主要分離自一些特殊環(huán)境中的微生物，例如熱泉、深海熱液、廢水處理廠等特殊環(huán)境微生物。在商業(yè)上也因其在高溫下具有較高的反應(yīng)效率，可以減少微生物污染的可能性，降低反應(yīng)溶液的黏度，提高底物的溶解度等特點，而受到越來越多的重視，并且已經(jīng)有很多耐熱脂肪酶被純化、克隆和進行酶學(xué)性質(zhì)的研究，被廣泛應(yīng)用于洗滌劑和生活污水等方面（劉秀萌等，2016）。因此，篩選產(chǎn)高溫脂肪酶的菌株成為了一項重要的工作。本試驗以大理彌渡熱泉底泥為材料，篩選出能產(chǎn)耐高溫脂肪酶的菌株，并對其分類鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究，為脂肪酶的發(fā)酵工業(yè)新備選菌株的開發(fā)應(yīng)用提供資源，為進一步開發(fā)利用該菌株提供基礎(chǔ)，也為進一步獲得產(chǎn)脂肪酶基因的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 土壤樣品 土壤樣品來自大理彌渡縣石夾泉熱泉的底泥，熱泉水溫43℃。

1.1.2 主要儀器 顯微鏡（奧林巴斯），紫外可見光分光光度計（上海菁華儀器公司），高速冷凍離心機（上海安亭科學(xué)儀器公司），恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），水浴恒溫?fù)u床（常州國華電器有限公司），高壓蒸汽滅菌鍋（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司），超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），PCR擴增儀（美國ABI），電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.1.3 試劑 酵母抽提物、蛋白胨為英國進口；瓊脂粉為西班牙進口分裝；三丁酸甘油酯、氯化鈉、結(jié)晶紫、碘、乙醇、孔雀綠、番紅均為國產(chǎn)分析純試劑；DNA抽提試劑盒、PCR擴增試劑盒、膠回收試劑盒和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品均購自北京天根生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基：蛋白胨5 g/L，酵母粉1 g/L；自然pH。

篩選培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，三丁酸甘油酯2 ml/L，瓊脂粉20 g/L；自然pH。

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0。

基本發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2.5 g，蛋白胨10 g，K2HPO40.5 g，硫酸銨 0.5 g，硫酸鎂 0.25 g，橄欖油5 mL，加蒸餾水定容至500 mL，自然pH。上述培養(yǎng)基均在121℃，0.1 MPa下滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株富集 稱取石夾泉熱泉底泥2 g于45 mL的無菌蒸餾水中，150 r/min，振蕩15 min。在無菌條件下，用移液槍吸取5 mL懸液于50 mL的富集培養(yǎng)基中，將接種好的富集培養(yǎng)基置于43℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min的水浴恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)24 h。

1.2.2 菌株初篩 將富集好的菌液稀釋至10-3、10-6、10-9倍，用移液槍分別吸取稀釋的菌液150μL接種在篩選培養(yǎng)基平板上，涂布均勻。于37℃，倒置培養(yǎng)24 h。菌落周圍如果有透明圈出現(xiàn)，說明該菌株能產(chǎn)生脂肪酶。

1.2.3 菌株復(fù)篩 將初篩得到的菌株取少量接種于種子瓶 （LB液體培養(yǎng)基），43℃培養(yǎng)24 h后，將種子液按2%的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基，43℃，150 r/min水浴搖床培養(yǎng)一周。離心取上清測酶活性。

酶活性測定：參照江慧芳等（2007）的方法進行。配制對硝基苯棕櫚酸酯（p-NPP）底物溶液10 mmol/L和對硝基苯酚（p-NP）標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mmol/L：將p-NP標(biāo)準(zhǔn)溶液用1 mol/L的碳酸鈉溶液稀釋成 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μmol/L 10個梯度，分別取1 mL，再分別加入0.5 mol/L的三氯乙酸1 mL和0.5 mol/L的NaOH 3 mL，混勻后410 nm處測定吸光度，繪制對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取20μL p-NPP底物溶液，加入780μL Tris-HCl緩沖液，37℃預(yù)熱5 min后加入200μL酶液，反應(yīng)10 min后加入0.5 mol/L的三氯乙酸1 mL，混勻后放置5 min終止反應(yīng)，再加入0.5 mol/L的NaOH 3 mL調(diào)pH，（將200μL蒸餾水替換200μL酶液，其他條件不變，即得空白），于410 nm處測定吸光度。對照標(biāo)準(zhǔn)曲線算出生成的p-NP濃度，進而計算出酶活力。

酶活力單位定義為：在一定條件下，每分鐘釋放出1μmoL對硝基苯酚的酶量定義為1個酶活力單位（U）。

計算公式：X=c V/t V'；

式中：X為脂肪酶活力，U/mL；c為對硝基苯酚濃度，μmol/L；V為酸堿調(diào)節(jié)后的反應(yīng)液終體積，mL；V'為酶液的用量，mL；t為作用時間，min。1.2.4 菌株鑒定

1.2.4.1 形態(tài)學(xué)、生理生化特征 產(chǎn)酶菌株的形態(tài)觀察及生理生化試驗參照黃秀梨等（2008）的方法進行。

1.2.4.2 16SrRNA基因序列測序和分析 根據(jù)北京天根生化科技有限公司提供的試劑盒以及說明書進行DNA的提取。使用通用引物 27F:5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3， 和 1492R:5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，擴增細(xì)菌 16SrDNA。擴增條件為：預(yù)變性94℃，5 min；變性94℃，30 s；退火 50 ℃，45 s；延伸 72 ℃，100 s，最后延伸72℃，5 min，循環(huán)30次，將PCR產(chǎn)物加入預(yù)先制備好的0.8%的瓊脂糖凝膠中，140 V，電泳1 h，瓊脂糖凝膠回收根據(jù)北天根生化科技有限公司提供的試劑盒以及說明書進行PCR產(chǎn)物回收。將PCR回收產(chǎn)物送廣州英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測序，將獲得的序列提交GenBank （http://www.ncbi.nlm.nih.gov），根據(jù)BLAST數(shù)據(jù)庫中細(xì)菌16SrRNA基因序列進行相似性比較分析，利用MEGA 5.0軟件進行系統(tǒng)進化分析。

1.2.5 菌株最適生長溫度 按接種量為1%的菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，置于不同的溫度（25、31、37、43、49、55 ℃）下?lián)u床培養(yǎng) 24 h，然后在波長600 nm處測定各個溫度下菌株生長的吸光值，以確定菌株的最適生長溫度。

1.2.6 酶學(xué)性質(zhì)

1.2.6.1 溫度對酶活力的影響 將酶液分別在4～75℃條件下測定脂肪酶的活力。

1.2.6.2 pH對酶活力的影響 在最適酶活力溫度下，配制不同pH的反應(yīng)緩沖液，檢測不同的pH對脂肪酶活力的影響。

1.2.6.3 酶的熱穩(wěn)定性 將1 mL酶液分別置于不同的溫度（4、25、37、55、75 ℃）下保溫，保溫一定時間后測定酶活力，以保溫0 min溫度下所測得的酶活力為對照組，其余溫度下所測得的酶活力與其相比并計算相對酶活力，用相對酶活力繪制出酶的熱穩(wěn)定性曲線。

1.2.6.4 金屬離子對酶活力的影響 將1 mL的酶液和10μL濃度為0.1 mol/L的金屬離子（Ca2+、Fe2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Mg2+、K+）混勻，將其放置到4℃冰箱過夜，第二天測定各組酶活力。以未加入金屬離子的酶液反應(yīng)體系作為對照組，測定和觀察金屬離子對酶活力的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶菌株的篩選 根據(jù)水解圈直徑與菌落直徑比值的大小，篩選出3株產(chǎn)高溫脂肪酶菌株，其中1號菌株水解圈直徑與菌落直徑比值（R1/R2）最大。經(jīng)復(fù)篩發(fā)現(xiàn)3株菌均為分泌型脂肪酶產(chǎn)生菌，且1號菌株酶活最高，達(dá)到106.5 U/mL，與初篩的結(jié)果相符。因此，選擇1號菌株作為后續(xù)試驗研究菌株，命名為Lip-43。

2.2 菌種鑒定

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗，計量資料以表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2.1 形態(tài)學(xué)、生理生化特征 Lip-43在LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)72 h后，菌落呈乳白色，不透明，圓形隆起，黏稠，不易挑取。革蘭氏染色為陰性，菌體呈球桿狀，無芽孢。

對Lip-43的生理生化特性進行研究，發(fā)現(xiàn)V-P試驗、甲基紅試驗結(jié)果均為弱陽性；吲哚試驗、明膠試驗結(jié)果均為陰性；乳糖發(fā)酵試驗結(jié)果為陰性；葡萄糖發(fā)酵試驗、蔗糖發(fā)酵試驗結(jié)果均為能利用糖，但不產(chǎn)氣。

2.2.2 16SrRNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育分析 16S rRNA基因測序，所獲得的序列長度為1440 bp，將Lip-43的16SrRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行相似性比對，發(fā)現(xiàn)Lip-43與不動桿菌屬的16SrRNA基因序列自然聚類，Lip-43的16SrRNA基因序列與13條相似性較高的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），從圖中可以看出Lip-43與Acinetobacter sp.Acinetobacterbaumannii的菌株聚為一群，相似性也最高，表明Lip-43與Acinetobacter sp.的親緣關(guān)系最近。

根據(jù)Lip-43的形態(tài)及生理生化特征，結(jié)合《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》（第八版）（布坎南等，1984），以及Lip-43 16SrRNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹，將Lip-43初步鑒定為不動桿菌屬（Acinetobacter sp.）的一株菌，命名為Acinetobacter sp.Lip-43。

2.3 菌種的最適生長溫度 按照試驗方法，在波長600 nm處測定不同溫度培養(yǎng)下LB培養(yǎng)基的吸光值，以600 nm處的吸光值為縱坐標(biāo)，溫度為橫坐標(biāo)作溫度—吸光值關(guān)系曲線，結(jié)果如圖4。

從圖4中可知，溫度為25～37℃時，菌體的生長量隨著溫度的升高而增加，37℃時，LB培養(yǎng)基在600 nm下的吸光值最高，表明37℃是菌株的最適生長溫度。37℃以后，菌體生長量隨著溫度的升高而下降，菌株在55℃下菌體還有一定生長，菌株屬于典型的耐高溫菌。

2.4 菌株Lip-43的脂肪酶性質(zhì)

2.4.1 對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線 根據(jù)制作對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，制作出的對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為Y=0.0036X+0.0006，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9905，表明線性比較好。

2.4.2 溫度對酶活的影響 按照試驗方法，在不同溫度下測定酶的活性，以酶活力為縱坐標(biāo)，溫度為橫坐標(biāo)作溫度—酶活關(guān)系曲線（圖5）。

從圖5可以看出，低溫能抑制酶的活性，但不能使酶失活，在4℃的條件下，脂肪酶仍具有活性，但活性較低，4～75℃，隨著溫度升高，酶活力增加，在45℃時，酶活力達(dá)到最大值，為106.5 U/mL，在45℃之后，隨著溫度升高，脂肪酶活力反而降低，部分酶失去活性。酶反應(yīng)都有一個最適反應(yīng)溫度，在沒有達(dá)到最適反應(yīng)溫度之前，酶活力隨著溫度升高而增加，超過最適反應(yīng)溫度，酶開始失活，反應(yīng)速度降低，45℃是脂肪酶的最適反應(yīng)溫度，菌株產(chǎn)生的脂肪酶屬于典型的耐熱脂肪酶。

2.4.3 脂肪酶的最適反應(yīng)pH 從圖6可以看出，pH 5.0之前，脂肪酶活力隨著pH的升高而升高，在pH 5.0之后，脂肪酶活力下降且下降速度較快，酶促反應(yīng)都有最適pH，當(dāng)反應(yīng)體系pH大于或者小于酶促反應(yīng)的最適pH時，酶活力相對于最適酶促反應(yīng)pH條件下的酶活力較低。因此，pH 5.0是該脂肪酶的最適反應(yīng)pH，表明菌株Lip-43產(chǎn)生的脂肪酶屬于酸性脂肪酶。

2.4.4 脂肪酶熱穩(wěn)定性 測定各個溫度下不同時間點脂肪酶的酶活，以保溫0 min溫度下所測得的酶活為對照組，其余溫度下所測得的酶活與其相比并計算相對酶活，用相對酶活繪制出酶的熱穩(wěn)定性曲線，結(jié)果如圖7所示。

由圖7可以看出，Lip-43脂肪酶在37℃以下能夠在長時間內(nèi)保持相對穩(wěn)定的酶活，表明該酶可在較低的溫度下保存，酶在75℃保溫120 min，相對酶活損失近50%，菌株產(chǎn)生的酶雖然是高溫脂肪酶，但酶在較高的溫度下，酶活性隨著保溫的時間增加而降低，酶的熱穩(wěn)定性較差，溫度耐受性質(zhì)符合一般酶的性質(zhì)。

2.4.5 金屬離子對酶活的影響 本試驗中將加有金屬離子的稀釋酶液在4℃中保溫過夜，以未加入金屬離子的酶液反應(yīng)體系作為對照組，測定各種金屬離子對酶活力的影響，結(jié)果見圖8。

從圖8可知，Zn2+和Ca2+對脂肪酶的活力有一定的抑制作用，其余離子均有一定的促進作用，其中Mn2+對脂肪酶活力的促進作用最為明顯，金屬離子可通過與酶的活性中心結(jié)合，影響酶活性。因此，Zn2+和Ca2+與酶的活性基團結(jié)合，抑制酶的活性中心與底物結(jié)合，使酶活性降低。其余金屬離子與酶活性中心結(jié)合后，改變了酶活性基團的構(gòu)象，使底物與活性中心結(jié)合能力更強，酶活力增加。

3 結(jié)論

本試驗從大理彌渡白總旗熱泉篩選到一株能向胞外分泌高溫脂肪酶的菌株，經(jīng)初步鑒定為不動桿菌，命名為Acinetobacter sp.Lip-43。菌株最適生長溫度為37℃，菌株在55℃仍能生長。酶學(xué)性質(zhì)研究表明：最適反應(yīng)溫度為45℃，最適反應(yīng)pH為5.0，為酸性脂肪酶。該酶在4、25、37℃下能在較長時間內(nèi)保持穩(wěn)定，Zn2+和Ca2+對Lip-43脂肪酶的活力有一定的抑制作用，Mn2+、K+、Mg2+、Fe2+、Cu2+均對Lip-43脂肪酶活力具有一定的促進作用，其中Mn2+的促進效果最為明顯。