皮膚再生醫(yī)療技術(shù)對糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合及血管生成的影響

覃曉潔 麻華膽 鄭愛甜

【摘要】?目的?觀察皮膚再生醫(yī)療技術(shù)（moist exposed burn therapy/moist exposed burn ointment，MEBT/MEBO）對糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合及血管生成的影響，探討MEBT/MEBO促進糖尿病創(chuàng)面愈合的機制。方法?SPF級Wistar雄性大鼠24只，STZ注射建立糖尿病大鼠模型后隨機分為對照組及MEBO組，各12只，背部切除建立創(chuàng)面，對照組創(chuàng)面給予生理鹽水外敷治療，MEBO組創(chuàng)面給予濕潤燒傷膏（moist exposed burn ointment，MEBO）外敷治療。于治療第5天、第11天觀察創(chuàng)面愈合情況及病理變化，行微血管計數(shù)，并采用免疫熒光法檢測創(chuàng)面組織CD31水平。結(jié)果?第5天，兩組創(chuàng)面愈合率比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），第11天，MEBO組創(chuàng)面愈合率高于對照組（P<0.001）;第5天，兩組創(chuàng)面組織病理恢復情況及微血管計數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），第11天，MEBO組創(chuàng)面病理恢復情況優(yōu)于對照組，微血管計數(shù)高于對照組（P<0.001）;血管標記物CD31顯示第5天兩組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），第11天MEBO組明顯高于對照組（P<0.001）。結(jié)論?MEBT/MEBO可通過促進糖尿病創(chuàng)面新生血管形成而促進創(chuàng)面愈合。

【關(guān)鍵詞】?皮膚再生醫(yī)療技術(shù);糖尿病;潰瘍創(chuàng)面;微血管;CD31

中圖分類號：R587.1?文獻標志碼：A?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.12.003

【Abstract】?Objective?To observe the effect of moist exposed burn therapy/moist exposed burn ointment （MEBT/MEBO） on wound healing and angiogenesis of diabetic ulcers， and to explore the mechanism of MEBT/MEBO in promoting diabetic wound healing.Methods?After establishing diabetic rat model by STZ injection， 24 male Wistar rats of SPF grade were randomly divided into control group and MEBO group， with 12 rats in each group. The wounds in the control group were treated with saline by external application， and the wounds in the MEBO group were treated with MEBO by external application. And then， the wound healing and pathological changes were observed on the 5th and 11th day after treatment， microvessel count was performed， and CD31 level in wound tissue was detected by immunofluorescence method.Results?On the 5th day， there was no statistically significant difference in wound healing rates between the two groups （P > 0.05）， on the 11th day， the wound healing rate of the MEBO group was higher than that of the control group （P < 0.001）; on the 5th day， there was no statistically significant difference in pathological recovery and microvessel count between the two groups （P > 0.05）， on the 11th day， the pathological recovery of the MEBO group was better than that of the control group， and the microvessel count was higher than that of the control group （P < 0.001）; the CD31 of vascular marker showed no statistically significant difference between the two groups on the 5th day （P > 0.05）， but on the 11th day， the MEBO group was significantly higher than the control group （P < 0.001）.Conclusion?MEBT/MEBO can promote wound healing by promoting neovascularization of diabetic wound.

【Key words】?MEBT/MEBO; diabetes mellitus; ulcer wound; microvessel; CD31

糖尿病創(chuàng)面是糖尿病常見的嚴重并發(fā)癥之一，是一種慢性難愈合創(chuàng)面[1]。由于發(fā)病原因復雜，機制尚未完全明確，臨床治療很困難。中醫(yī)藥在慢性處理中具有獨特效果，皮膚再生醫(yī)療技術(shù)（moist exposed burn therapy/moist exposed burn ointment，MEBT/MEBO）在臨床上應(yīng)用30余年，對糖尿病等慢性創(chuàng)面療效顯著[2～4]，但具體機制尚未闡明。新生微血管形成在創(chuàng)面愈合中具有重要作用，本研究擬通過觀察MEBT/MEBO對糖尿病創(chuàng)面及創(chuàng)面血管生成的作用，探討MEBT/MEBO促進糖尿病創(chuàng)面愈合的機制。

1?材料與方法

1.1?實驗動物

SPF級Wistar雄性大鼠24只，3月齡，體重230 g～260 g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供。該實驗經(jīng)右江民族醫(yī)學院動物倫理委員會批準。

1.2?方法

1.2.1?糖尿病創(chuàng)面模型的建立

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，禁食16小時，腹腔注射STZ建立糖尿病大鼠模型，1周后大鼠出現(xiàn)糖尿病癥狀且空腹血糖≥16.7 mmol/L為模型建立成功。在糖尿病模型組大鼠成功建立1周后，腹腔注射水合氯醛進行麻醉，備皮，碘伏消毒，在大鼠背部行直徑約為2.5 cm×2.5 cm的全層皮膚切除創(chuàng)面，創(chuàng)面深度要求達到筋膜層，建立糖尿病創(chuàng)面模型。

1.2.2?實驗分組及藥物干預(yù)

大鼠隨機分為對照組（糖尿病模型組）和濕潤燒傷膏（moist exposed burn ointment，MEBO）組，各12只，創(chuàng)面每日換藥2次，對照組給予生理鹽水紗布外敷，MEBO組給予濕潤燒傷膏（汕頭市美寶制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準字Z20000004，40 g/支）紗布外敷，每日檢測血糖并予胰島素常規(guī)控制。

1.2.3?標本采集與處理

分別于第5天、第11天2個時相點麻醉后采集創(chuàng)面組織（第11天為公認的糖尿病創(chuàng)面修復期）[5]。各組織樣本均給予10%福爾馬林固定制作HE染色切片和CD31免疫組化檢測。

1.2.4?創(chuàng)面平均愈合率

分別于上述2個時相點，以刻度尺作為參照，并對創(chuàng)面進行拍照，采用Image J軟件測量未愈合創(chuàng)面的面積并計算愈合率，創(chuàng)面愈合率=（原始的創(chuàng)面面積-未愈合的創(chuàng)面面積）/原始的創(chuàng)面面積×100%。

1.2.5?HE染色觀察病理改變并進行微血管計數(shù)

將采集的創(chuàng)面組織放置于10%福爾馬林溶液中固定24小時后，行石蠟包埋后制作病理切片，使用光學顯微鏡觀察創(chuàng)面形態(tài)學變化并行微血管計數(shù)（每張切片由3位觀察者分別計數(shù)，取平均值）。

1.2.6?免疫熒光CD31染色

組織切片脫蠟水化后按流程進行CD31免疫熒光染色，觀察血管標記物CD31表達差異。

1.3?統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料符合正態(tài)分布，以（±s）表示，組內(nèi)第5天、第11天比較采用配對t檢驗，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準：α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2?結(jié)?果

2.1?創(chuàng)面愈合率比較

第5天，兩組創(chuàng)面愈合率比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），第11天，MEBO組創(chuàng)面愈合率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。見表1。

2.2?創(chuàng)面病理組織及微血管數(shù)量比較

第5天，兩組創(chuàng)面均表現(xiàn)為組織水腫、大量炎癥細胞浸潤、少量纖維細胞及毛細血管形成，其中對照組水腫及炎癥細胞浸潤較MEBO組更嚴重;第11天，兩組創(chuàng)面炎癥細胞浸潤減輕，肉芽組織形成，對照組炎癥細胞浸潤更明顯，成纖維細胞及毛細血管分布較MEBO組稀疏紊亂。微血管形成數(shù)量比較顯示：第5天，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），第11天，MEBO組數(shù)量多于對照組（P<0.001）。見圖1，表2。

2.3?免疫熒光CD31染色比較

CD31免疫熒光染色顯示：第5天，兩組OD值比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），第11天，MEBO組表達明顯多于對照組（P<0.001）。見圖2，表3。

3?討?論

糖尿病創(chuàng)面是常見的慢性創(chuàng)面，慢性創(chuàng)面愈合是目前醫(yī)學難題，涉及新生血管生成、細胞生長、外基質(zhì)形成等，其中新生血管形成是創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵，在創(chuàng)面愈合過程中具有十分重要的意義[6～7]。新生微血管形成后，可給創(chuàng)面細胞提供養(yǎng)分，促使創(chuàng)面細胞生長，肉芽組織形成，促進創(chuàng)面愈合。新生血管越多，能為創(chuàng)面提供更多的氧氣和營養(yǎng)成分，肉芽組織生長越快，創(chuàng)面越容易愈合[8～9]。

中醫(yī)藥治療糖尿病足歷史悠久，MEBT/MEBO基于“去腐生肌、煨膿長肉、活血化瘀”等機理促進創(chuàng)面愈合，已有研究表明其能提高潰瘍創(chuàng)面肉芽組織血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）水平，促進創(chuàng)面生長[10～11]。本研究表明，采用MEBO處理創(chuàng)面后，至第11天，創(chuàng)面愈合率明顯高于僅采用鹽水干預(yù)的糖尿病模型組，表明了MEBO對糖尿病創(chuàng)面愈合具有良好的促進作用。進一步研究顯示，MEBO組新生血管計數(shù)及血管陽性標記物CD31明顯高于對照組，表明MEBO可有效促進糖尿病創(chuàng)面新生血管形成，具有促進新生微血管生成的作用，通過促進新生血管生成，為創(chuàng)面組織提供養(yǎng)分，促進創(chuàng)面組織的生長，創(chuàng)面愈合。

MEBO是純中藥成分，主要組分有黃柏、黃連、地龍、黃芩、罌粟殼等，通過現(xiàn)代醫(yī)學手段，發(fā)現(xiàn)其主要含β-谷甾醇、黃芩甙、小檗堿等，臨床實踐已證實這些藥物成分具有活血化瘀、祛腐生肌、煨膿長肉等功效，基于這些功效，從中醫(yī)理論看，MEBO兼具促進組織細胞生長血液循環(huán)、新生血管再生等作用。多項研究表明，MEBO可通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路調(diào)控VEGF分泌，從而促進內(nèi)皮細胞生長，新生血管形成，本實驗結(jié)果也顯示，經(jīng)MEBO干預(yù)治療后，創(chuàng)面血管陽性標記物CD31升高，新生血管數(shù)量增多，驗證了MEBO的促血管生成作用。綜上，MEBT/MEBO可有效促進糖尿病創(chuàng)面愈合，促進新生血管形成是其重要機制之一。

參?考?文?獻

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（收稿日期：2020-08-17?修回日期：2020-12-01）

（編輯：王琳葵?梁明佩）