氮限制時間對海綠球藻和微綠球藻生長、總脂含量及脂肪酸組成的影響

梁 英, 紀維瑋, 石偉杰, 2, 田傳遠, 胡乃霞, 閆譯允

氮限制時間對海綠球藻和微綠球藻生長、總脂含量及脂肪酸組成的影響

梁 英1, 紀維瑋1, 石偉杰1, 2, 田傳遠1, 胡乃霞1, 閆譯允1

(1. 海水養殖教育部重點實驗室(中國海洋大學), 山東 青島 266003; 2. 國家海洋局秦皇島海洋環境監測中心站, 河北 秦皇島 066002)

本文研究了不同氮限制時間(0、1、2、4、6 d)對海綠球藻()和微綠球藻()葉綠素熒光參數、細胞密度、生物量、葉綠素含量、總脂含量以及脂肪酸組成的影響。本實驗結果表明, 海綠球藻的最大相對電子傳遞速率rETRmax和快速光曲線的初始斜率α都隨氮限制時間增加而降低, 而光系統II最大光能轉化效率vm、非光化學淬滅NPQ以及最小飽和光照強度Ik都有先增加后下降的趨勢, 各參數都在氮限制第6 d達到最小值。微綠球藻上述各參數的變化趨勢均為隨著氮限制時間增加而逐漸下降。隨著氮限制時間增加, 海綠球藻和微綠球藻細胞密度都有較小幅度的增加, 分別在第5 d和第6 d達到最大值; 兩種綠藻的葉綠素含量均隨氮限制時間的增加而降低, 氮限制0 d時葉綠素含量最高, 6 d時葉綠素含量最低; 在氮限制第2 d時二者總脂產率都達到最大值, 分別為0.021 g·(L·d)–1和0.017 g·(L·d)–1, 由此可見, 適合海綠球藻和微綠球藻產脂的最佳氮限制時間均為2 d。海綠球藻和微綠球藻的脂肪酸主要包括16:0、18:0、20:0、18:1n-9、18:2n-6和16:3n-3等。氮限制對海綠球藻的18:1n-9和MUFA(單不飽和脂肪酸總和)影響顯著, 均隨氮限制時間增加而增加, 而PUFA(多不飽和脂肪酸總和)含量隨氮限制時間增加而降低; 氮限制對微綠球藻的16:0、18:1n-9、16:3n-3、MUFA和PUFA有顯著影響, 隨著氮限制時間增加, 16:0、18:1n-9及MUFA含量逐漸增加, 而16:3n-3和PUFA含量逐漸降低。本實驗結果可為進一步開發海綠球藻和微綠球藻并對其進行大規模培養提供理論依據。

海綠球藻; 微綠球藻; 氮限制; 細胞密度; 葉綠素熒光參數; 總脂含量; 脂肪酸組成

近年來, 由于各種環境問題, 可持續生物燃料替代物一直是研究的重點。目前, 將可再生的生物柴油用作燃料則是一種備受關注的發展方向。微藻因含有較多脂類而成為生物柴油原料的良好選材之一[1]。微藻的細胞組分(如蛋白質、脂類、色素等)會隨著培養條件的改變而改變[2]。許多研究表明, 環境因子(如溫度、光照、pH、鹽度等)能夠對微藻生長產生影響, 其中光照是重要影響因子, 通過影響葉綠素a的合成從而影響微藻的光合作用及其生長, 同時對細胞內油脂等生化成分產生影響[3-6]。另外, 養分限制尤其是氮限制, 通常是增加微藻細胞中特定目標成分的有效途徑。國內外學者通過對藻類生物量和脂類積累的研究, 為生物柴油生產技術發展提供了參考[7]。在氮限制條件下, 大部分微藻有可能積累大量的脂類或碳水化合物[8]。

氮元素在所有生物的生長發育過程中都是必不可少的營養元素, 并且它還參與多數生物大分子的合成。研究發現, 氮限制條件可促進某些藻細胞的分裂, 并且使蛋白質合成受抑制,從而抑制細胞內色素合成, 大幅降低了光合作用效率, 而三酰甘油(TG)及活性氧(ROS)的含量顯著提高[9]。Han等[10]在半連續培養條件下進行了蛋白核小球藻()的培養, 研究表明, 氮限制可以使細胞的脂質含量增加。Bona等[11]研究發現, 氮限制是富油新綠藻()生產脂肪酸的一種簡便操作策略。吳瓊芳等[12]在不同初始NaNO3濃度條件下培養普通小球藻(Beijierineck), 結果表明適當氮限制可以促進普通小球藻細胞內脂質的積累。近年來, 很多學者對多種微藻進行了氮限制條件下的研究[13-16], 發現不同微藻種類、氮限制程度及時間等因素都會對微藻生物量、總脂含量和脂肪酸組成造成不同程度的影響。目前看來, 影響微藻生長及總脂含量的具體氮限制時間的相關研究較少, 需要對此開展進一步的研究。

海綠球藻()生長速度較快, 有潛力作為優良的生物柴油原料。微綠球藻()富含多種營養, 具有較高的油脂含量, 且較易于培養, 也可作為產油微藻[17]。目前, 石偉杰[18]及梁英[19]的相關報道顯示, 海綠球藻和微綠球藻總脂含量能分別達到干重的35.80%和40.42%。本實驗以海綠球藻及微綠球藻作為實驗材料, 研究不同氮限制時間對二者的生長及總脂含量影響, 為提高藻細胞的生物量、積累更多的生物活性物質及大規模培養提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藻種來源及實驗設計

用于本研究的海綠球藻()和微綠球藻()藻種, 均來源于中國海洋大學水產學院微藻實驗室, 代號分別為MACC/C11和MACC/C14。

實驗所用培養基為f培養基, 即f/2培養基[20]營養鹽濃度的兩倍, 將40 mL處于指數生長期的兩種藻分別接種到2000 mL的f培養基中, 均以5×105個/mL作為初始接種密度, 設置3個重復。藻種在溫度(25±1)℃,鹽度31, 光照強度100 μmol·m–2?s–1的條件下連續充空氣培養。到指數生長末期, 將每瓶2 000 mL藻液平均分為5份, 每份400 mL, 將每份藻液離心收獲后,分別接種到400 mL不含氮的f培養基中進行氮限制實驗, 氮限制時間設定為0、1、2、4和6 d, 每份對應一個氮限制時間, 每個處理組3個重復, 培養時間共為6 d, 培養條件同上。每天于固定時間取藻液適量, 進行細胞密度及葉綠素熒光參數測定。在氮限制0、1、2、4、6 d后分別離心收獲這兩種藻, 進行單位體積干重及葉綠素含量、總脂及脂肪酸含量的測定。

1.2 各項參數測定

細胞密度用血球計數板測定4次, 并取其平均值。葉綠素熒光參數的測定按梁英等[21]的方法進行, 用Platt等[22]的方程快速擬合光曲線, 得到以下參數: 最大相對電子傳遞速率rETRmax, 快速光曲線的初始斜率α和最小飽和光照強度Ik。光系統Ⅱ最大光能轉化效率vm及非光化學淬滅NPQ可直接讀取。葉綠素含量測定使用戴榮繼等[23]的方法進行。

生物量使用電子分析天平測定, 用單位體積干重表示, 單位為g·L–1。總脂含量(用占干重百分比表示)用改進的Bligh-Dyer法[24]進行測定。總脂產量g·L–1的計算公式為: 總脂產量=總脂含量×干重。總脂產率g·(L·d)–1計算公式為: 總脂產率=總脂含量×干重/培養天數。

脂肪酸含量測定參照梁英等[25]的方法, 首先對離心收獲后的樣品進行冷凍干燥處理, 然后用改進的乙酰氯甲醇方法[26]將樣品甲酯化, 最后萃取脂肪酸甲酯, 待分層后, 取上清液進行脂肪酸分析。

1.3 數據處理

數據使用SPSS24軟件處理, 以0.05為差異顯著標準, 進行單因子方差分析及多重比較。作圖使用Sigmaplot12.5軟件。

2 結果與分析

2.1 氮限制時間對海綠球藻和微綠球藻葉綠素熒光特性的影響

圖1為海綠球藻和微綠球藻在氮限制0~6 d時的快速光響應曲線, 根據快速光響應曲線擬合得到參數如表1所示。由單因子方差分析結果可以看出, 氮限制時間對海綠球藻和微綠球藻的rETRmax、α和Ik的影響具有顯著性差異(<0.05)。由表可知, 海綠球藻的rETRmax從第1 d開始隨氮限制時間的增加逐漸降低, 在氮限制6 d時達到最小值。α在氮限制0~2 d逐漸降低, 氮限制2 d后變化不顯著。Ik在氮限制0~ 1 d時增加, 第1 d達到最大值, 而后隨氮限制時間的增加逐漸降低, 在氮限制的第5 d達到最小值。由圖2可知氮限制時間對海綠球藻光系統Ⅱ最大光能轉化效率vm、非光化學淬滅NPQ產生的影響, 經分析也具有顯著性差異(<0.05)。海綠球藻在氮限制0~1 d時vm值從0.69增加到0.72, 1~5 d隨氮限制時間的增加而逐漸下降, 到氮限制第6 d時下降至0.68。在氮限制1~3 d時, NPQ值逐漸增加, 在第3 d達到最大值后, 隨氮限制時間的增加, 該值整體趨勢為逐漸減小。

由表1可以看出, 隨氮限制時間延長, 微綠球藻的rETRmax隨之明顯降低。α變化趨勢為隨氮限制時間的增加持續降低。圖3表明, 微綠球藻的vm值在氮限制0~1 d時稍有增加, 從0.70增至0.72, 1 d后逐漸降低, 到氮限制第6 d時降低至最小值0.64。NPQ值隨氮限制時間的增加先降低, 在氮限制4 d時達到最小值, 然后逐漸升高。

圖1 不同氮限制時間下海綠球藻和微綠球藻的快速光響應曲線

表1 不同氮限制時間對海綠球藻和微綠球藻快速光響應曲線參數的影響

注: 多重比較分析結果按升序排列, 即a

圖2 不同氮限制時間下海綠球藻光系統Ⅱ最大光能轉化效率及非光化學淬滅的變化

圖3 不同氮限制時間下微綠球藻光系統Ⅱ最大光能轉化效率及非光化學淬滅的變化

2.2 氮限制時間對海綠球藻和微綠球藻細胞密度、生物量和葉綠素含量的影響

圖4所示為不同氮限制時間下海綠球藻和微綠球藻細胞密度的變化。隨著氮限制時間增加, 海綠球藻細胞密度有較小幅度的增加, 氮限制6 d時細胞密度是0 d時的1.08倍; 微綠球藻的細胞密度逐漸增加, 且總體變化幅度較小, 在氮限制的第5 d達到最大值, 此時細胞密度是0 d時的1.08倍。

圖4 不同氮限制時間下海綠球藻和微綠球藻細胞密度的變化

不同氮限制時間下海綠球藻和微綠球藻生物量及葉綠素含量的變化如表2所示。海綠球藻在氮限制0 d時生物量最低, 隨氮限制時間增加其生物量增加, 且氮限制1~6 d之間生物量沒有顯著性差異。微綠球藻生物量的變化趨勢與海綠球藻相一致。由表可知, 兩種藻的葉綠素含量均隨氮限制時間的增加而逐漸降低。氮限制0~1 d時海綠球藻的葉綠素含量顯著高于2~6 d時海綠球藻的葉綠素含量, 微綠球藻在氮限制0 d時葉綠素含量最高, 6 d時葉綠素含量達到最小值。

2.3 氮限制時間對海綠球藻和微綠球藻總脂含量、總脂產量和總脂產率的影響

表3所示的是不同氮限制時間下海綠球藻和微綠球藻的總脂含量、總脂產量和總脂產率。由表可以看出, 海綠球藻的總脂含量和總脂產量均隨氮限制時間的增加而逐漸增加。海綠球藻在氮限制0 d時的總脂含量(34.93%)和總脂產量(0.16 g?L–1)處于最小值, 氮限制4 d時, 該藻的總脂含量和總脂產量均達到最大值, 分別為47.34%和0.25 g?L–1, 比0 d時增加了35.53%和56.25%。氮限制2 d時海綠球藻總脂產率達到最大值0.021 g?(L?d)–1, 顯著高于其他氮限制時間的總脂產率, 總體呈現先增加后減少的趨勢。總脂產率這一指標通過反映油脂積累速率, 可以完善產油藻株的評價標準, 因此, 2 d是海綠球藻的最佳氮限制時間。

表2 不同氮限制時間下海綠球藻和微綠球藻生物量及葉綠素含量的變化

表3 不同氮限制時間下海綠球藻和微綠球藻的總脂含量、總脂產量及總脂產率

隨著氮限制時間的增加, 微綠球藻的總脂含量及總脂產量逐漸增加。氮限制0 d時, 微綠球藻的總脂含量(33.36%)和總脂產量(0.14 g?L–1)處于最小值。氮限制6 d時, 該藻的總脂含量和總脂產量均達到最大值, 分別為47.46%和0.23 g?L–1, 比0 d時增加42.23%和64.29%。隨氮限制時間的延長, 微綠球藻總脂產率先增加后減少, 在氮限制2 d時達到最大值0.017 g?(L?d)–1, 顯著高于其他氮限制時間的總脂產率。因此, 2 d是微綠球藻的最佳氮限制時間。

2.4 氮限制時間對海綠球藻和微綠球藻脂肪酸組成的影響

不同氮限制時間下海綠球藻脂肪酸的組成如圖5所示。由圖可知, 海綠球藻的主要脂肪酸是16:0(18.04%~20.40%)、18:0(3.87%~6.09%)、20:0 (1.72%~2.41%)、18:1n-9(40.96%~52.62%)、16:3n-3 (4.05%~7.11%)和18:2n-6(13.96%~17.81%)。單因子方差分析結果顯示, 氮限制對海綠球藻的18:0、20:0及SFA(飽和脂肪酸總和)的影響差異不顯著(>0.05), 而對18:1n-9、MUFA(單不飽和脂肪酸總和)以及PUFA(多不飽和脂肪酸總和)的影響具有顯著性差異(<0.05)。隨著氮限制時間增加, 海綠球藻的18:1n-9和MUFA逐漸增加, 其含量在0 d時最低, 6 d時最高, 比0 d時增加了28.47%。海綠球藻的PUFA含量隨氮限制時間增加而降低, 在氮限制0 d和1 d時含量較高, 氮限制2、4、6 d時含量降低且3個處理組之間沒有顯著性差異。

圖5 不同氮限制時間下海綠球藻的脂肪酸組成(占總脂肪酸的百分比)

圖6所示為不同氮限制時間下微綠球藻脂肪酸的組成。由圖可知, 微綠球藻的主要脂肪酸是16:0 (24.48%~26.69%)、18:0(5.08%~5.71%)、20:0(1.61%~ 2.76%)、18:1n-9(39.23%~47.18%)、16:3n-3(3.94%~ 6.85%)和18:2n-6(11.27%~13.63%)。單因子方差分析結果表明, 氮限制對微綠球藻的18:0、18:2n-6及SFA的影響差異不顯著, 而對該藻的16:0、18:1n-9、16:3n-3、MUFA和PUFA的影響具有顯著性差異, 微綠球藻的16:0、18:1n-9及MUFA含量都在氮限制0 d時較低, 隨著氮限制時間增加含量逐漸增加, 其中, 16:0含量在氮限制6 d時比0 d時增加了9.03%, 但與氮限制1、2、4 d的含量差異不顯著。18:1n-9和MUFA含量在氮限制2 d時最高, 比0 d時增加了20.27%。而隨氮限制時間增加, 16:3n-3和PUFA含量逐漸降低, 兩者均在氮限制0 d時含量最高, 6 d時含量最低, 分別比0 d時降低了42.48%和28.07%。

圖6 不同氮限制時間下微綠球藻的脂肪酸組成(占總脂肪酸的百分比)

3 討論

葉綠素熒光技術常用于光合作用研究之中。rETRmax表示最大相對電子傳遞速率, α是光響應曲線的初始斜率[27]。本實驗結果顯示, 海綠球藻和微綠球藻rETRmax和α值的變化趨勢均為隨氮限制時間的增加而逐漸降低, 表明氮限制不利于海綠球藻和微綠球藻的光合作用, 微藻細胞在氮限制條件下, 同化作用受阻, 光合電子傳遞被抑制, 光能利用效率下降, 增加了熱能等形式的耗散。這與王璐瑤等[28]對金色奧杜藻()研究結果相一致, 金色奧杜藻的Pm(Pm即代表最大相對電子傳遞速率rETRmax)隨氮濃度下降而降低, 說明氮素的營養水平直接影響了微藻細胞的表觀光合生理狀況。最小飽和光照強度Ik值在實驗期間總體呈下降趨勢, 表明氮限制導致光合反應中心被破壞, 從而使微藻的強光耐受力降低, 影響其光合作用, 導致微藻生長受阻。v/m表示光系統Ⅱ最大光能轉化效率, 反映微藻在遭受環境脅迫時光合作用所受到的影響, 當處于不良環境中時該值會明顯下降[29]。在實驗過程中, 海綠球藻和微綠球藻的葉綠素熒光參數vm均隨氮限制時間的增加而降低, 且最小值均出現在實驗結束即氮限制6 d時。該值呈下降趨勢反映出海綠球藻和微綠球藻的光化學能量轉換受到影響, 光系統Ⅱ的氧化端被破壞, 且由于氮限制使藻細胞合成蛋白質受阻, 無法及時修復受損部位, 原初反應受到抑制。徐興蓮[30]對威氏海鏈藻()等硅藻進行研究, 發現vm值在氮限制條件下顯著降低, 光系統II的光化學活性隨氮限制時間延長而逐漸降低, 與本實驗得到的結果一致。NPQ的變化反映熱耗散變化, 在本實驗中, NPQ隨氮限制時間的增加而逐漸上升, 說明藻細胞利用提高NPQ的方式來散失過多光能[31], 通過保證光合系統穩態來減少細胞損傷。綜合以上結果可以看出, 氮限制破壞海綠球藻和微綠球藻細胞光系統Ⅱ反應中心, 從而阻礙電子傳遞, 進一步降低光合作用效率。

氮是組成微藻細胞內生物大分子的基本元素之一, 氮的缺乏或限制會使微藻的生長和胞內的營養代謝受到影響[32]。許海等[33]研究表明, 斜生柵藻()和銅綠微囊藻()在無氮的BG11培養基中長速較慢, 10 d時細胞密度較0 d時基本不變, 說明兩種藻在氮限制條件下生長受到抑制。本研究結果表明, 隨著氮限制時間逐漸增加, 海綠球藻和微綠球藻的細胞密度有小幅度的增加, 與許海等的研究結果有所不同。其原因可能是由于本研究中使用的是天然海水配置的f培養基, 天然海水本身含有少量的氮, 實驗所用藻種是海水藻, 而許海等是用純水配置BG11培養基, 實驗所用藻種是淡水藻。一些學者的研究結果與本實驗結果一致。夏榮霜等[34]對東海原甲藻()進行氮限制培養10 d發現, 在實驗早期(氮限制0~4 d)藻細胞密度逐漸升高, 認為此時藻細胞生長、分裂所受抑制較弱, 氮限制4~6 d時細胞密度基本保持不變, 6~10 d時逐漸下降。梁英等[16]對筒柱藻(sp.)的研究表明, 隨氮限制時間增加, 其細胞密度先升高而后又小幅降低, 氮限制8 d時為0 d時的1.35倍。Li等[35]研究發現, 隨著氮限制時間增加, 富油新綠藻的細胞密度在一定時間內增加, 而單個細胞中的葉綠素含量逐漸下降。Li等認為葉綠素含量下降的原因是細胞中的葉綠素在缺氮條件下分解, 將分解所得到的氮用于合成更重要的物質(如蛋白質、核酸)來供應細胞生長。若缺氮條件持續下去, 葉綠素含量低至一定臨界值時, 細胞生長就會受阻, 細胞密度將停止增加。在本實驗過程中得到了相似的結果, 海綠球藻和微綠球藻的葉綠素含量均隨氮限制時間增加而逐漸下降。其原因可能是當缺乏氮元素時, 胞內的氮不足以進行葉綠素的合成。

氮缺乏引起的應激反應是微藻改變脂質代謝的一種自然機制[36]。雖然缺氮條件對細胞內多種成分的產生有所抑制, 但仍能保持較高的脂質合成速率, 使藻細胞中油脂增多[37]。本實驗中, 海綠球藻在氮限制4 d時總脂含量達到最高值, 比0 d時增加了35.53%。微綠球藻在實驗結束即氮限制6 d時總脂含量達到最高值, 比0 d時增加了42.23%。胡章喜等[32]認為, 細胞內的蛋白質、糖類等含氮較多的物質在氮限制條件下無法合成, 而脂類含氮較少, 所以此時光合作用所獲得的能量用于合成脂類化合物, 導致胞內總脂含量增加。Xin等[38]則認為, 細胞內類囊體膜含量在氮限制條件下會減少, 從而使乙酰水解酶(PAF- AH)被激活, 磷脂被水解。細胞內乙酰輔酶A(CoA)可能因此增多, 且氮限制可使甘油二脂酰轉移酶活化, 此酶使CoA轉化為甘油三脂(TG), 因此氮限制可增加細胞內總脂含量。周芷薇等[39]在低氮脅迫(硝酸鈉濃度為3.6 mmol?L–1)的條件下培養兩種高產油微藻發現, 斧形魏氏藻()在3~9 d時總脂含量增加, 此后逐漸平穩; 點狀魏氏藻()在0~12 d時總脂含量逐漸增加, 而后趨于平穩。由此可以看出, 氮限制對微藻總脂含量的影響與微藻種類、限制程度及限制天數等因素相關。李濤等[40]研究結果表明, 僅以總脂含量及生物量為標準不足以評價產油藻株, 可以利用總脂產率反映油脂積累速率來彌補, 因此本實驗將總脂含量和總脂產率兩個參數相結合, 綜合評價氮限制時間對海綠球藻和微綠球藻油脂積累的影響。在實驗過程中, 隨氮限制時間增加, 海綠球藻和微綠球藻總脂含量顯著升高, 總脂產率先增加后減少, 兩種藻的總脂產率均在氮限制2 d時達到最高值, 由此可以得出, 2 d是海綠球藻和微綠球藻的最佳氮限制時間。

氮限制也影響微藻的脂肪酸組成。梁英等[16]采用“兩步法”對筒柱藻進行研究的結果表明, 筒柱藻的SFA含量隨氮限制時間增加先升高后降低, MUFA含量隨氮限制時間的增加而上升, PUFA含量隨氮限制時間的增加而減少。本實驗得出的氮限制時間對海綠球藻和微綠球藻MUFA和PUFA含量影響的結果與上述研究結果一致, 而與之不同的是, 本實驗中SFA含量隨氮限制時間增加變化不顯著。兩個實驗都是采用“兩步法”進行氮限制試驗, 氮限制時間對SFA含量影響的差異可能是由于微藻種類不同造成的。在周芷薇等[39]的研究中, 兩種魏氏藻飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸的相對含量隨著低氮脅迫時間增加而逐漸上升, 多不飽和脂肪酸的相對含量則隨之下降。焦媛媛[41]對小球藻的研究發現, 氮限制條件更有利于飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸的合成, 而抑制多不飽和脂肪酸的合成。從上述兩個研究得到的結果來看, 氮限制對微藻單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸的影響與本研究基本一致, 而對飽和脂肪酸的影響因藻種不同而有所差異。生物柴油的主要成分為十六烷酸、十八烷酸、十八烯酸、十八碳二烯酸等長鏈飽和與不飽和脂肪酸同甲醇或乙醇所形成的酯類化合物[42], 相關研究顯示, 脂肪酸鏈長為C15~C22、不飽和程度較低的原料更適合用于生物柴油的生產[43], 因為不飽和程度高的脂肪酸會降低氧化穩定性、影響燃燒熱以及十六烷值[44]。本實驗脂肪酸分析結果顯示, 海綠球藻和微綠球藻含有的脂肪酸主要為C16及C18系脂肪酸, 隨著氮限制時間的增加, 海綠球藻的18:1n-9含量以及微綠球藻的16:0、18:1n-9含量逐漸增加, 兩種藻的PUFA含量降低, 總體不飽和程度降低, 因此兩種藻的脂肪酸組成比較適于生產生物柴油。

4 結論

有研究表明, 利用氮限制的方法雖可以有效提高微藻的總脂含量, 但會降低其生物量。本實驗針對此問題采用了“兩步法”, 先將海綠球藻和微綠球藻在最適條件下培養到指數生長末期, 離心后轉接到相同體積的不含氮的培養基中培養。實驗結果表明, 海綠球藻和微綠球藻的總脂含量分別在氮限制第4 d和第6 d達到最高值。二者在氮限制2 d時總脂產率都達到最高, 因此二者產脂的最佳氮限制時間均為2 d, 且此時兩種藻的葉綠素熒光參數及生長狀況也都處于較為理想的狀態。此外, 海綠球藻的18:1n-9和MUFA含量隨氮限制時間增加而逐漸升高, 在6 d時達最高值, PUFA含量在氮限制1 d時含量最高, 而后降低; 微綠球藻的18:1n-9和MUFA含量在2 d時最高, 而PUFA含量隨氮限制時間增加而逐漸降低, 在0 d時最高。氮限制對兩種微藻SFA含量的影響差異不顯著。本實驗結果可為海綠球藻和微綠球藻的大規模生產、培養和利用提供理論依據。

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Effects of nitrogen limitation time on growth, total lipid con-tent, and fatty acid composition ofand

LIANG Ying1, JI Wei-wei1, SHI Wei-jie1, 2, TIAN Chuan-yuan1, HU Nai-xia1, YAN Yi-yun1

(1. The Key Laboratory of Mariculture (Ocean University of China), Ministry of Education, Qingdao 266003, China; 2. Marine Environment Monitoring Central Station of Qinhuangdao, State Oceanic Administration, Qinhuangdao 066002, China)

The present study evaluated the effects of nitrogen limitation time (0d, 1d, 2d, 4d, 6d) on various biochemical parameters ofand, including chlorophyll content, cell density, chlorophyll fluorescence parameters, total lipid content, and fatty acid composition. For, increase in the nitrogen limitation time resulted in a time dependent decrease in maximum photosynthetic efficiency (rETRmax)as well as initial slope of rapid curve (α). In comparison to these, maximum photochemical efficiency of PSⅡ (v/m), non-photochemical quenching (NPQ), and minimum saturating irradiance (Ik) showed an initial increase, which was followed by a decline with further increase in the nitrogen limitation time. Nitrogen limitation severely affected chlorophyll fluorescence parameters that reached minimum values on day 6. For, all the parameters showed a gradual decrease with increase in the nitrogen limitation time. The cell density was observed to increase slightly with an increase in the nitrogen limitation time and maximum cell density was achieved on day 5 and day 6 forand, respectively. As the nitrogen limitation time increased, the chlorophyll content present in single cell was found to decrease in both the species. Total lipid production was maximum on day 2 of nitrogen limitation, with a total lipid content of 0.021g?(L?d)–1and 0.017g?(L?d)–1inand, respectively. Thus, the optimum nitrogen limitation time for lipid production inandwas two days. The fatty acid composition ofandmainly includes 16:0, 18:0, 20:0, 18:1n-9, 18:2n-6, and 16:3n-3 molecules.Nitrogen limitation time was found to severely affect the levels of 18:1n-9 and MUFA in. The levels of 18:1n-9 and MUFA showed a positive correlation with nitrogen limitation time, while PUFA levels showed a negative correlation. Nitrogen limitation time showed significant effects on the levels of 16:0, 18:1n-9, 16:3n-3, MUFA and PUFA in. The levels of 16:0, 18:1n-9 and MUFA increased while 16:3n-3 and PUFA decreased with increase in the nitrogen limitation time. Therefore, these results provide an insight into the effects of nitrogen limitation on various parameters ofand, which could be exploited for large-scale cultivation and exploitation ofand

;; nitrogen limitation; cell density; chlorophyll fluorescence parameter; total lipid content; fatty acid composition

Aug. 31, 2019

[Supported by the Key Research and Development Program of Shandong Province (2017GHY15104); National Technologies Program of China during the 12thFive-Year Plan Period (2011BAD14B01)]

S968.4

A

1000-3096(2020)02-0045-11

10.11759/hykx20190831002

2019-08-31;

2019-11-21

山東省重點研發計劃項目(2017GHY15104); “十二五”國家科技支撐計劃(2011BAD14B01)

梁英(1967-), 女, 山東萊陽人, 教授, 博士, 主要從事微藻生理生化研究, E-mail: yliang@ouc.edu.cn

(本文編輯: 趙衛紅)