陣列式柔性紙基SERS細(xì)菌檢測芯片的制備

陳 李，李丹陽，楊 峰，徐 溢，李順波

(1.重慶大學(xué) 光電技術(shù)與系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新型微納器件與系統(tǒng)技術(shù)重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，重慶 400044；2.中國科學(xué)院 傳感器技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200050)

1 引 言

表面增強(qiáng)拉曼(Surface-Enhanced Raman Scattering, SERS)技術(shù)具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)，非接觸測量，不被水分子干擾等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)[1]、環(huán)境監(jiān)測[2]、重金屬離子檢測[3-4]、食品安全檢測[5-9]及細(xì)菌病原體檢測[10-11]等領(lǐng)域。SERS技術(shù)主要利用金屬納米結(jié)構(gòu)的拉曼增強(qiáng)特性來大幅提高檢測靈敏度，因此制備良好的活性基底是獲得高質(zhì)量拉曼信號的關(guān)鍵。目前構(gòu)建金屬納米結(jié)構(gòu)SERS基底的方法主要包括光刻技術(shù)(如紫外、電子或離子束、光近場光刻等)、機(jī)械加工技術(shù)(如礙磨、拋光等)、化學(xué)氣相沉淀[12]、光誘導(dǎo)組裝、自組裝、膠體凝聚和膜沉積生長等[13]。

近年來，微生物的快速檢測日益受到重視，如水和食品的微生物污染、傷口的微生物感染等。在環(huán)境水質(zhì)監(jiān)測和食品安全檢測中，大腸桿菌是重要的指示微生物[14]。SERS光譜具有非接觸和非破壞的特點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)對細(xì)菌的快速無損檢測，利用SERS技術(shù)檢測微生物的研究報(bào)道迅速增加。2015年，Ma等[15]以DTNB為拉曼標(biāo)記分子，利用磁珠的分選富集作用以及DNA鏈間的雜交作用力，實(shí)現(xiàn)對細(xì)菌DNA的選擇性檢測。2018年，王等[16]將大腸埃希菌O157∶H7與其特異性適配體共同孵育，并采用原位還原納米銀的方法，在大腸埃希菌O157∶H7-適配體表面原位還原納米銀顆粒，形成納米銀殼，通過SERS技術(shù)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)細(xì)菌的特異性檢測。2019年，L. M.等[17]利用SERS技術(shù)篩選大腸桿菌次級代謝物，使用HCL，DCM等對樣品進(jìn)行預(yù)處理，提取樣品中pHCA / CA，實(shí)現(xiàn)對細(xì)菌菌株次級代謝物的篩選。

紙基材料作為最常見的柔性材料，以使用便捷、可大批量制造、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)備受研究者青睞。紙基SERS芯片是將紙作為載體，將金屬納米粒子附著于紙質(zhì)表面，從而制成SERS增強(qiáng)活性基底?，F(xiàn)有報(bào)道的紙基SERS基底制作方法有浸泡法[18-19]、噴墨打印法[20-21]和絲網(wǎng)印刷[22]等。但這些方法也存在不足：浸泡法的浸泡時(shí)間較長，且難以控制納米結(jié)構(gòu)的密度；噴墨打印方法對溶膠的黏度、濃度要求較為嚴(yán)格，否則容易堵塞，而且多層打印時(shí)不容易對準(zhǔn)；絲網(wǎng)印刷通常適用于高黏度的溶膠，且網(wǎng)版的制版過程相對復(fù)雜。

本文針對細(xì)菌的高通量、快速檢測，設(shè)計(jì)并制備了一種陣列式紙基SERS芯片，采用激光打印制作隔離區(qū)，通過溶膠循環(huán)滴加、加熱干燥的方法制作陣列式SERS芯片，成功實(shí)現(xiàn)對大腸桿菌的快速檢測。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 基本原理

實(shí)驗(yàn)中選擇A4打印紙用于SERS芯片的基底材料，其制備及檢測流程如圖1所示。首先采用激光打印機(jī)在A4紙上構(gòu)造出圖形陣列。利用碳粉的疏水性，在紙張表面形成隔離結(jié)構(gòu)(黑色部分)和檢測區(qū)(白色區(qū)域)。然后將制備的銀溶膠滴加在芯片檢測區(qū)，由于隔離區(qū)的疏水特性，可將銀溶膠有效地限制在檢測區(qū)范圍內(nèi)，在一定溫度下讓銀溶膠自然干燥即可獲得納米銀結(jié)構(gòu)。重復(fù)進(jìn)行銀溶膠滴加、干燥過程，可對銀納米顆粒的密度進(jìn)行調(diào)控，形成最終的陣列式柔性紙基SERS芯片。

圖1 芯片制備及檢測流程

2.2 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

實(shí)驗(yàn)中采用的試劑有：硝酸銀，檸檬酸鈉，普通A4紙，羅丹明6G和超純水。

實(shí)驗(yàn)中采用的測試儀器有：532 nm拉曼光譜儀(LabRAM HR Evolution，HORIBA)，紫外可見分光光度計(jì)(UV-2450，日本島津)和掃描電子顯微鏡(JEOL JSM-7800F，日本)。

2.3 銀溶膠制備

將0.001 mol/L AgNO3(100 mL)溶液與1%檸檬酸鈉溶液(2.6 mL)常溫下混合[23]，攪拌均勻。之后將混合溶液加熱至沸騰狀態(tài)，持續(xù)10～15 min，再自然冷卻至室溫，即可得到乳白色銀溶膠。制得的銀溶膠如圖2(a)所示。

圖2 銀溶膠及其紫外-可見光譜吸收峰測定

3 實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

3.1 銀溶膠吸收峰測定

利用紫外-可見吸收光譜儀對銀溶膠的吸收峰進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖2(b)所示。從圖中可以看出，在415 nm波長有一個(gè)強(qiáng)吸收峰，為單峰且半峰寬為110 nm，可知該峰是直徑約為30 nm的銀納米粒子的等離子共振吸收峰[24]。

3.2 紙基SERS芯片制備

利用移液槍每次取6 μL銀溶膠，滴加在檢測區(qū)域，常溫下避光干燥，得到紙基SERS芯片。其中空白襯底圖如圖3(a)所示，按上述步驟制備的SERS芯片如圖3(b)所示。在圖3(b)中，從左至右每列銀溶膠滴加層數(shù)依次為1～6，從圖中可以看出隨著銀溶膠滴加層數(shù)的增加，芯片檢測區(qū)的顏色不斷加深。

圖3 紙基芯片

利用前述方法對不同種類紙張進(jìn)行比較，以選取最佳襯底。實(shí)驗(yàn)滴加次數(shù)均為3，以10-6mol/L的羅丹明6G做為探針。紙張包括打印A4紙、牛皮紙、蠟紙和濾紙，SERS測試結(jié)果如圖4所示。

從圖中可以看出：在其他條件一致時(shí)，不同紙基芯片獲得的羅丹明6G拉曼譜峰位置基本一致?？傮w上A4打印紙的拉曼峰強(qiáng)度最大，牛皮紙和蠟紙的拉曼峰強(qiáng)度相對較弱，而使用濾紙襯底制作的芯片，其拉曼峰強(qiáng)度非常弱。主要原因是濾紙的孔隙相對比較大，使得銀納米顆粒的分布過于分散，粒子間距較大，因此增強(qiáng)因子比較?。慌Ｆぜ埓植诙容^大，同樣不利于納米粒子的均勻分布；蠟紙表面疏水，干燥后的納米粒子發(fā)生明顯團(tuán)聚，也使得增強(qiáng)因子下降。因此，最終選用A4打印紙作為襯底。

圖4 不同種類紙張檢測的羅丹明6G拉曼光譜

3.3 最佳銀溶膠層數(shù)

銀納米顆粒的密度對SERS信號增強(qiáng)系數(shù)有重要的影響，根據(jù)本芯片的制作工藝可知，沉積在紙基底上的銀納米顆粒密度與銀溶膠循環(huán)滴加次數(shù)有關(guān)。為了得到較好的拉曼增強(qiáng)效果，首先對銀溶膠的滴加次數(shù)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。利用3.2的實(shí)驗(yàn)方法，制備不同銀溶膠層數(shù)的紙基芯片。然后，選擇羅丹明6G作為拉曼探針分子，將它滴加在紙基SERS芯片的檢測區(qū)域上，干燥后使用532 nm激發(fā)波長的拉曼光譜儀進(jìn)行測量，激發(fā)光功率為0.125 mW，積分時(shí)間為1 s。不同層數(shù)基底的增強(qiáng)效果對比圖如圖5(a)所示。

從圖5(a)中可以看出：銀溶膠層數(shù)小于5時(shí)，隨著層數(shù)的增加，信號強(qiáng)度逐步增強(qiáng)；而層數(shù)大于5時(shí)，信號強(qiáng)度有所降低。圖5(b)是實(shí)驗(yàn)中檢測10-6mol/L羅丹明6G的拉曼光譜，拉曼峰明顯，檢測效果顯著，故最終滴加次數(shù)確定為5。

用SEM表征實(shí)驗(yàn)制備的紙基芯片，其SEM圖像如圖6所示。從圖中可以看出，表面銀納米顆粒為絨球狀，銀顆粒聚集在紙張內(nèi)部纖維附近。銀團(tuán)簇的存在會(huì)產(chǎn)生大量的活性SERS熱點(diǎn)，從而可獲得較強(qiáng)的拉曼增強(qiáng)系數(shù)，提高檢測靈敏度。

圖5 實(shí)驗(yàn)拉曼光譜

圖6 芯片掃描電鏡圖像

3.4 羅丹明6G檢出限表征

使用5層銀溶膠的紙基芯片，檢測不同濃度的羅丹明6G的拉曼光譜，對芯片的檢出限進(jìn)行表征。

拉曼光譜檢測方法與3.3節(jié)相同，不同濃度的羅丹明6G檢測對比如圖7(a)所示。從圖中可以看出，隨著羅丹明6G濃度的減小，信號強(qiáng)度逐漸減小。探針分子的濃度減小到10-8mol/L時(shí)， 612，1 180，1 360 cm-1峰位依然存在，說明該基底能夠?qū)崿F(xiàn)對10-8mol/L的檢測，如圖7(b)所示，圖中其他峰位為空白基底的拉曼峰位。

3.5 芯片一致性表征

陣列式SERS芯片可實(shí)現(xiàn)高通量的測量，但是各檢測區(qū)的一致性對實(shí)際應(yīng)用非常重要，因此選取陣列式紙基芯片的不同檢測區(qū)位置，評估拉曼增強(qiáng)性能的一致性。

針對上述實(shí)驗(yàn)制備的陣列式紙基芯片，隨機(jī)測量3個(gè)不同檢測區(qū)，檢測10-6mol/L羅丹明6G的拉曼光譜，結(jié)果如圖8(a)所示。從圖中可以看出，其典型峰位在612，1 360，1 510，1 650 cm-1。選取612 cm-1處特征峰進(jìn)行分析，3次測量的峰高如圖8(b)所示，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差約為11.85%，表明該基底具有較好的一致性。

圖7 不同濃度羅丹明6G的拉曼光譜

圖8 重復(fù)性測量結(jié)果

3.6 大腸桿菌檢測

大腸桿菌通常作為水質(zhì)監(jiān)測和食品檢測的指示菌，利用該紙基芯片進(jìn)行大腸桿菌的無標(biāo)記直接檢測。將大腸桿菌溶液滴加在紙基SERS芯片的檢測區(qū)進(jìn)行拉曼光譜檢測，其拉曼光譜如圖9(a)所示。

根據(jù)文獻(xiàn)[17]，大腸桿菌特征峰大約在650,730,960,1 000,1 330,1 460,1 570 cm-1的位置。

從圖9中可以觀察到，除了紙基芯片自身的的拉曼峰位，還能明顯觀察到1 333，1 463，1 566 cm-1處的大腸桿菌峰位，說明利用該紙基底能夠?qū)崿F(xiàn)對大腸桿菌的直接、快速檢測。根據(jù)已有報(bào)道[17，25]，SERS對細(xì)菌等微生物的檢測還存在較大局限性，靈敏度較低，給定量測量帶來了較大的挑戰(zhàn)，目前暫時(shí)無法對菌種檢測限進(jìn)行確切的測量。

圖9 大腸桿菌檢測

4 結(jié) 論

為實(shí)現(xiàn)微生物快速檢測，本文設(shè)計(jì)制備了陣列式柔性紙基SERS芯片，闡述了芯片的結(jié)構(gòu)和制備工藝，采用SEM和羅丹明6G探針分子對芯片進(jìn)行了表征，基于該芯片實(shí)現(xiàn)了對大腸桿菌的直接檢測。

利用紫外-可見吸收光譜方法，得到銀溶膠的強(qiáng)吸收峰位于415 nm波長處，表明銀顆粒直徑約為30 nm。芯片表面銀納米結(jié)構(gòu)SEM表征結(jié)果顯示，銀納米結(jié)構(gòu)在紙纖維上呈絨球狀分布，提供了大量的SERS活性熱點(diǎn)。羅丹明6G探針分子對SERS增強(qiáng)性能表征結(jié)果顯示，滴加5層銀溶膠的SERS芯片信號強(qiáng)度最強(qiáng)，能夠?qū)崿F(xiàn)對10-8mol/L羅丹明6G的檢測，且任意3個(gè)檢測區(qū)的RSD為11.85%，顯示出較好的一致性。采用該紙基芯片對大腸桿菌進(jìn)行檢測，無需對樣本進(jìn)行標(biāo)記等預(yù)處理，即可直接獲得其拉曼特征峰，每個(gè)樣本的檢測時(shí)間小于1 min。該陣列式柔性紙基SERS芯片具有結(jié)構(gòu)簡單、制作快速、成本低廉的特點(diǎn)。目前，基于SERS的細(xì)菌含量檢測相對較為復(fù)雜，無法對細(xì)菌含量進(jìn)行定量分析，下一步將在此基礎(chǔ)上，開展基于主成分分析等算法的微生物種類識(shí)別和菌種含量檢測，有望應(yīng)用于微生物的快速、高通量檢測。