液質聯用技術的應用與發展

徐曉雅,陳 鑫,鄧惠婷,張中琪

（武警安徽省總隊醫院，安徽 合肥 230061）

現代物理分析方法非常靈敏,以至于即使是很小的樣本,它們也能提供精確而詳細的信息。由于這些原因,它們現在被用于產品開發,制造和配方控制,存儲期間的穩定性檢查以及藥品和藥物的使用監控。定量分析中使用了各種方法,可大致分為化學/經典方法(滴定法,體積法和重量法）、儀器方法(分光光度法,極譜法,HPLC,GC）。液相色譜-質譜(LC-MS或HPLC-MS）是一種分析技術,它結合了液相色譜(或HPLC）的物理分離能力和質譜分析的質量分析能力。LC-MS是一種用于許多應用的強大技術,具有非常高的靈敏度和選擇性。它通常用于藥物的藥代動力學研究,并且是生物分析領域中最常用的技術[1-2]。

1 LC-MS的基本原理

目前的液相色譜法通常使用非常小的顆粒填充并在相對高的壓力下操作,并稱為高效液相色譜(HPLC）,基本原理是吸附。質譜(MS）是一種測量帶電粒子的質荷比的分析技術。它用于確定顆粒質量,確定樣品或分子的元素組成,以及用于闡明分子(如肽和其他化合物）的化學結構。MS通過電離化學化合物來產生帶電分子或分子碎片并測量它們的質荷比。在典型的MS程序中,將樣品加載到MS儀器上并進行蒸發。通過各種方法(例如:通過用電子束撞擊它們）使樣品的組分電離,這導致帶電粒子(離子）的形成。離子在分析儀中通過電磁場根據它們的質荷比分離。通常通過定量方法檢測離子,離子信號被處理成質譜。此外,MS儀器由三個模塊組成。離子源,可以將氣相樣品分子轉化為離子(或者,在電噴霧電離的情況下,將溶液中存在的離子移動到氣相中）。質量分析儀,通過施加電磁場對質量進行分類。檢測器,測量指示劑量的值,從而提供用于計算存在的每種離子的數據。該技術具有定性和定量用途。這些包括識別未知化合物,確定分子中元素的同位素組成,以及通過觀察其碎片來確定化合物的結構。MS現在在分析實驗室中非常普遍,用于研究各種化合物的物理、化學或生物學性質[3]。

HPLC僅僅能分離物質,幾乎不提供有關化學物質的額外信息。事實上,如果它只含有一種化學物質,HPLC很難確定特定峰的純度。在此添加質譜可以告訴您峰中存在的所有化學物質的質量,可用于識別它們,以及純度的檢查。即使是簡單的質譜也可以用作質量特異性檢測器,特定于所研究的化學品。與其他色譜方法相比,LC-MS具有很多優點:(1）選擇性:洗脫峰可通過質量選擇性分離,不受色譜分離度的限制。(2）分子量信息:確認和鑒定已知和未知化合物。(3）結構信息:受控碎裂可以對化學品進行結構解析。(4）快速方法開發:無需保留時間驗證即可輕松識別洗脫的分析物。(5）樣品基質適應性:減少樣品制備時間,從而節省時間。(6）定量:通過有限的儀器優化,可以輕松獲得定量和定性數據[4]。

2 LC-MS的各種應用

2.1 分子生藥學

LCMS確定不同組培養植物細胞的含量和類別,并選擇成分含量差異最大的一組去研究成分差異表型克隆[5]。

2.2 化合物的表征和鑒定

2.2.1 類胡蘿卜素

由于類胡蘿卜素不具有熱穩定性,混合物的分離和雜質的去除通常通過反相HPLC代替氣相色譜法進行,可以采用質譜和串聯質譜的數據來確認類胡蘿卜素鑒定。迄今為止,已有五種LC/MS技術用于類胡蘿卜素分析,包括移動帶,粒子束,連續流快速原子轟擊,電噴霧和大氣壓化學電離(APCI）[6]。

2.2.2 蛋白質組學

液相色譜/質譜(LC/MS）已成為藥物發現中蛋白質組學研究的一項強有力的技術,其中包括靶蛋白表征和生物標記物的發現。基于MS的糖蛋白質組學研究用于表征檢查中的糖肽串聯MS片段化和數據分析問題提供了完整糖肽的有效表征,然后通過液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS）進行肽的分析。例如,馬心肌肌紅蛋白模型樣品的蛋白質分析和肽質量作圖通過LC/MS使用四極質譜儀完成[7]。

2.3 定量和定性分析

2.3.1 生物樣品的定量分析

LC-MS/MS方法包括樣品制備,組分分離和MS/MS檢測以及若干領域的應用,如生物胺的定量,免疫抑制劑的藥代動力學和興奮劑控制。先進的技術包括LC-MS/MS儀器的自動化、色譜柱切換以及固相萃取的更高效使用,從而推動樣品凈化時間和總運行時間減少的趨勢。與傳統色譜技術相比,新引入的技術,如小顆粒(亞2 μm）的超高效液相色譜和單片色譜,可提高速度、分離度和靈敏度[8]。

2.3.2 復合脂質混合物的定性和定量分析

這是一種基于LC-MS的脂質混合物研究方法,已證明了其在分析人類脂蛋白相關脂質中的應用。在二氧化硅60上進行任選的初始分餾后,YMC PVA-Sil柱上的正相HPLC-MS首先用于分級,然后使用Atlantis dC18毛細管柱進行反相LC-MS或LC-串聯質譜分析,以完全表征各個脂質。這里應用的方法用于分析人載脂蛋白B相關脂質。這種方法可以測定每種分子種類的脂質含量,并且從正常個體分離的載脂蛋白B-100-LDL相關的脂質與含有載脂蛋白B-67的載脂蛋白相關的脂質能顯示出明顯的差異[9]。

2.3.3 植物成分/植物代謝組學

LC-MS提供了一種區分這種巨大植物生物多樣性的工具,因為該技術能夠分析多種代謝物,包括次生代謝物(如生物堿,甙類,苯丙酸類,類黃酮,異戊二烯,芥子油苷,萜類,苯甲酸類）和高級分子(低聚糖和脂質）。LC-MS是確定全局代謝物譜的主要非靶向分析技術之一,有助于鑒定和相對定量色譜圖中的所有峰,如最初由保留時間和分子量定義的離子。通過非靶向LCMS技術分析了欖仁果實的活性提取物[10-12]。

2.4 治療藥物監測中的自動免疫分析

某些具有較窄治療指數的藥物的治療藥物監測(TDM）有助于改善患者預后。對藥物進行準確、精確和標準化的測量這一需求對臨床實驗室和診斷行業來說是個重大挑戰。如今,基于液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS）的方法和免疫測定方法似乎是臨床實驗室中最廣泛使用的方法。基于質譜具有分析敏感性和特異性,并能夠在單個過程中測量多種化合物。這是一種監測接受多種藥物治療的患者(例如,結核病患者的抗菌治療）的經濟、有效的方法[13]。

2.5 臨床化學和毒理學

對于某些臨床化學和毒理學分析物,液相色譜(LC）與串聯質譜(MS/MS）配對提供了優于免疫測定的傳統測試的優勢。測試的分析物包括雌二醇、睪酮、甲狀腺激素、免疫抑制劑、維生素D、用于新生兒篩查程序的類固醇,以及臨床和法醫毒理學。雖然免疫測定通常用于臨床實驗室,但對于在常規臨床實驗室中測試的許多分析物而言,分析靈敏度和特異性較差。此外,LC-MS/MS可以多路復用,以實現高測試吞吐量和多種分析物檢測。LC-MS/MS在臨床化學和毒理學研究中的應用將得到改進,其優勢眾所周知。對于治療藥物的免疫測定很少,如果使用不當會導致毒性。無目標分析的目的是確定盡可能多的具有臨床或法醫重要性的藥物,無論是否有免疫測定。尿液通常是首選的樣本,但血清和血液也是少數重要的樣本類型[14]。

2.6 二維（2-D）連字技術

LC-MS的使用已經成為一種強大的二維(2D）聯用技術,可用于分析蛋白質、氨基酸、核酸、碳水化合物、脂類、多肽以及基因組學、脂質組學、代謝組學、蛋白質組學等領域。LCMS的組合是最優選的,能夠強化各種分析和生物分析技術。LC-MS技術可以以敏感和特殊的方式精確地區分復雜的混合物,這種混合類型的HPLC和MS組合可以進行復雜混合物的常規定性發現和定量定向分析,這可能是最重要的組合之一。開發和分離,質譜在過去十年中通過檢測各種分析和生物分析技術在科學領域發揮著重要作用。與LC系統相比,它提高了LC系統的穩健性和準確性,并在與MS系統結合時提高了檢測能力[15]。

3 LC-MS的未來前景

3.1 代謝組學

目前,基于質譜(MS）的代謝組學,MS已廣泛用于獲得有關人類,植物,藥物和生物標記物發現、營養研究、食品控制和微生物生物化學。

未來5到10年將不可避免地見證實驗室之間合作的增加,以便于更快、更多的獲得基于LC-MS的代謝物數據以及整理。對于具有類似模型樣本和儀器的感興趣的合作者,內部MS/MS庫可能會更容易獲得,從而增加了所有參與實驗室人員的知識基礎。通過對收集的LC餾分進行離線分析或通過混合LCNMR-MS儀器分析,NMR與基于LC-MS的代謝譜分析和代謝組學研究的整合可能會增加。相比之下,GC-MS不太可能成為LC-MS策略的集成組件,因為這兩種技術存在根本差異,并且難以將這些補充信息用于未知生物標志物表征。然而,由于相對較差的電離效率,GC-MS仍將是量化那些不適用于LC-MS分析的代謝物的工具。可能會出現新的信息學工具,用于結合自動生成候選經驗公式和立體異構體以生成檢測到的代謝物特征,以及用于基于CID MS/MS碎片光譜預測未知代謝物化學結構的算法。

基于MS的代謝組學更為積極的是,光譜數據庫的數量和質量在過去5年中顯著增加。然而,這種增長會產生其他需要盡快解決的問題,以便在代謝組學方面取得更加明顯的進展。兩個主要問題是顯而易見的,未來可以通過協調和統一的行動來最好地解決這些問題。問題一是,在化合物中心數據庫中僅報告了5%～10%的已知代謝物。應通過將有機化學和代謝組學相結合的國際計劃,以及可能涉及學術界和商業公司,解決來自真實化學標準的MS、MS/MS和MSn譜的增加。問題二是,盡管從毫無針對性的代謝組學研究中發現自然界中存在未知的代謝產物(即先前未發現）,但是由于加合物/片段闡明和化學/背景噪聲的錯誤,這種現象是否會失真尚不明確。代謝組學數據庫的較新前沿可以部分解決這個問題,代謝譜數據庫的特征是具有良好的質譜結構,其中包含參考物質的所有加合物和碎片種類。此外,保存來自真實化學標準品的全掃描(MS1）光譜數據和顯示加合物形成的差異,使其能夠估計處理基于LC/MS的非靶向代謝組學的方法。光譜數據庫有兩種相反的趨勢。首先,除了人類能力之外,越來越多的估計MS方法仍被用于提高參考精確質譜的質量。這包括信號處理和通過過濾來去除共同分離的峰,自動說明公式到片段峰以及光譜的重新校準甚至片段結構的注釋。除了增強信息之外,所有這些步驟都可以作為光譜的附加質量控制,包括檢測[16-17]。

3.2 蛋白質組學

在過去的十年中,用于肽段LC-MS儀器的驚人發展幾乎使蛋白質樣品制備(包括提取和消化）成為了蛋白質組學實驗中一個重要的關鍵點。與非蛋白質污染物相關的樣品清潔度會極大地影響蛋白質鑒定率。當前簡化樣品制備步驟和處理少量生物材料的趨勢已使蛋白質提取、消化和分離整合在單個移液器吸頭中,該吸頭裝有一小片嵌入分離材料的膜,即所謂的StageTip。考慮到蛋白質缺乏和植物細胞中化合物的干擾,將這些方案推廣到植物材料中具有挑戰性,但這是一個令人興奮的挑戰,因為研究SM的好處遠超過開發工作[18]。

3.3 藥物警戒

藥物警戒(PV或PhV）,被稱為藥物安全性。它是涉及藥物產品的不良副作用的收集、檢測、評估、監測和預防的藥理學之一。檢測和監測可以通過基于LC-MS的疾病修改技術完成,該技術能提供詳細的概況[19]。