載體固定化酶的應用及前景展望*

劉雪凌，林 貝

(燕京理工學院，河北 三河 065201)

20世紀60年代，酶固定化技術作為一種新技術發展迅速。這種技術可以在一定的空間范圍內將水溶性酶用物理或化學方法處理，使之成為不溶于水狀態，從而能反復和連續使用[1]。酶固定化技術使酶的穩定性增加，易從反應系統中分離，易于控制，便于運輸和貯存，有利于自動化生產，有廣闊的應用前景。

根據載體的有無可以將固定化酶分為載體固定化酶和無載體固定化酶。本文僅對載體固定化酶進行論述。

1 固定化酶載體的選擇特點

將酶固定在不溶性聚合物或無機載體上，因此該項技術被稱為載體固定化酶技術。其中，載體的種類、理化性質等都會對此技術造成影響[2]。

適宜的載體能夠提高載體固定化酶技術的使用效果，因此對載體進行選擇非常重要。

其選擇特點如下：考慮載體的理化性質，比如形狀、大小、孔徑、機械強度、能否耐酸堿腐蝕、能否耐高溫、能否耐微生物降解等；在載體材料方面，要考慮其材料是否價廉易得，能否進行工業化大生產等；能否再生循環使用，可以降低成本，節能減排[3]等。

2 載體類型

2.1 傳統載體

傳統載體主要是動植物的結構蛋白，為天然高分子產物，例如可以從蝦的甲殼中可以提取殼聚糖、甲殼素[4]；從海藻中可以提取海藻酸鈉等。常用的傳統載體除了殼聚糖、甲殼素、海藻酸鈉外[5]，還包括瓊脂糖凝聚、卵清蛋白、瓊脂糖珠、木質纖維[6]等。

這些載體的應用可以延長酶的壽命，提高酶的穩定性，可以多次回收反復利用，其酶的固定化工藝簡單易行；缺點是載體需要從大量原料中提取制備，材料機械性強度差，易被微生物分解，載體壽命比較短，可重復利用次數少。

2.2 新型載體

2.2.1 人工合成高分子材料

天然高分子可以通過修飾或者由化學手段人工合成高分子材料作為固定化酶的載體，其性能更加優秀。環氧樹脂進行化學修飾后成為功能性環氧樹脂，可以使固定化酶提高性能[7]；陰離子交換樹脂D202固定酶后，可以提高酶的活性，可連續使用28批次[8]；D380樹脂固定酶后，重復使用6次，酶活力仍可達到48.9%；聚苯乙烯二乙烯苯樹脂和D001樹脂也常被用來磷脂酶的固定；D3 11離子交換樹脂固定酶后，底物轉化率可高達91.3%[9]。

人工合成高分子材料載體可以大規模生產，機械性強度較高，理化性質確定；缺點是與酶分子結合不牢固，容易脫落，其材料的生物相容性比較差，有細胞毒性，因此，其發展受到一定的限制。

為了避免以上缺點，人們嘗試將天然高分子材料與人工合成高分子材料通過物理或者化學手段形成復合材料。復合材料可以由兩種或者兩種以上材料合成，通過復合效應產生原材料不具備的新性能。常見的復合材料包括天然高分子復合載體、合成一天然高分子復合載體以及無機-有機復合載體等。

海藻酸鈉、殼聚糖和明膠進行組合是天然高分子復合載體[10]最常見的一種復合方法，其固定酶后比單一性載體的穩定性高；也可以將纖維素衍生物醋酸纖維與聚四氟乙烯基膜[11-12]制成合成-天然高分子復合載體，更加有利于酶的固定。

2.2.2 無機新型材料

傳統的無機材料大多是從自然界直接獲得或者聯合其它物質制成的材料。它的優點是價廉易得、機械強度大、抗酸堿、抗有機溶劑、抗微生物分解等；缺點是其結構不好控制，固定酶的能力較差。

隨著科技發展，近些年來開發了很多新型無機材料，比如納米材料、介孔材料等，這些變化使無機材料具有了很多新的優異性能。

納米材料有很多優點，它們粒徑小，比表面積較大，表面結合能較大，可以容易與酶結合穩定，還能很好提高酶的負載量和酶的穩定性[12]。在生物醫學比如臨床診斷、靶向藥物和酶標中、在細胞學特別是細胞符號及細胞別離中、在生物工程的酶固定化中均可使用磁性納米材料，一般應用各種基團如-COOH、-CHO、-OH、-NH以及-SH等形成功能性分子[13]。磁性可以對使用的納米載體進行回收，提高商品的純度。常用的Fe3O4納米粒子通過不同鏈長的烷基硅烷修飾形成新型磁性納米材料；Fe3O4納米粒子還可以與聚乙二醇聚合，使酶固定性能進行改善[14]。除此之外，磁性納米材料還包括二氧化硅納米粒子、磁性纖維素納米晶體、磁性氧化氮納米顆粒等。磁性納米材料載體不僅有磁性特點，還有納米材料的有點，因此發展迅速。 碳基納米復合材料是近年來發展起來的又一新型納米材料載體。由石墨烯制成的復合材料超薄，其導熱性能、機械強度、化學穩定性、生物相容性方面都具有優良性能。其中，氧化石墨烯及其衍生物可以吸附金屬氧化物和固定酶。碳納米管具有良好的導電性能、吸附性能、生物相容性等，也被廣泛應用在酶固定上[15]。

無機新型介孔材料具有有序孔道結構、容易進行修飾、孔徑分布較窄、比表面積大、孔隙率高和機械穩定性好等優點[16]。此類載體常為介孔硅膠材料。應用表面活性劑液晶模板法可以制備得到有序介孔M41S系列[17]，包括MCM-41(六方狀)、MCM-48(立方狀)、MCM-36(層柱狀)、MCM-22(片狀)[18]等；應用溶膠-凝膠法可以合成HMS介孔材料系列[19]。

2.2.3 智能型酶固定化載體

研究發現，相比較傳統固定化酶方式，智能型載體具有獨特的優勢，優點是酶的負載量增加，酶的穩定性和活力均提高，底物和產物抑制降低，酶回收操作被簡化[20]。目前常用的智能型酶固定化載體有溫度敏感型、pH敏感型、離子敏感型、極性敏感型、光敏型、磁響應型、多重因素敏感型[21]等。由于目前大多數研究還停留在一些傳統材料的研發上，智能型酶固定化載體進行酶固定化受到了一些限制[22]。

3 酶的固定化方法

酶的固定化方法非常多，針對不同的載體，可以采用不同的方法，對酶進行固定。有時候在研究中需要綜合使用多種方法來進行固定。

3.1 化學固定化方法

化學固定化方法主要為共價鍵結合法。共價鍵結合法常通過醚、硫醚、酰胺或氨基甲酸酯鍵形成共價鍵，酶可以被不可逆固定化[23]。參與結合的官能團常常有由半胱氨酸、賴氨酸和天冬氨酸及谷氨酸的側鏈。該方法的影響因素較多，可以受到載體的親水性和穩定性、離子強度、pH和溫度等因素的影響，每一個因素的變化都可能導致固定化酶的性質發生變化[24]。此方法的優點是結合牢固，缺點是成本比較高。目前，共價鍵結合法研究較為深入且應用相對較廣泛。

交聯法是采用雙功能或多功能交聯試劑，通過在酶分子和交聯試劑之間形成共價鍵從而固定酶法。一般以幾丁聚糖、殼聚糖等為載體，使用戊二醛、乙二醛、乙二胺、鞣酸、順丁烯二酸酐及雙偶氮苯等多功能試劑作為交聯劑，可以將半乳糖苷酶、胃蛋白酶、脲酶等多種酶進行固定[25]。此方法的優點是：適用范圍很廣，既適用于固定化酶，又適用于固定化菌體。缺點是交聯反應比較強烈，固定化后的酶的活性回收率通常較低。如果降低交聯劑的濃度、縮短反應時間，可以提高酶活性的回收利用率，但因交聯劑的價格昂貴，因此單獨使用這種方法較少，通常采用兩種或多種固定法，將交聯法作為輔助方法。

3.2 物理固定化方法

物理吸附法是一種常用的物理固定化方法，原理主要是利用固體吸附劑把需要固定的酶吸附到其表面上從而實現固定化。吸附劑可以是活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷等有強吸附能力的不溶于水溶液的吸附材料[26]。還有人利用離子吸附法來固定酶，主要是應用具有離子交換基團的不溶性物質來吸附，通常使用陽離子和陰離子交換劑。此方法的優點是工藝非常簡單，操作條件比較溫和，從而酶的催化活力下降少，酶的構象基本或很少發生變化[27]；此方法可以采用的載體多、價格比較便宜；固定好的酶分子水平高，不容易發生斷裂，酶分子回收利用率高；載體也可以回收再利用。

包埋法是指將酶包埋在高聚物的凝膠型或微膠囊型的包埋劑里的固定化方法。包埋法是酶固定化研究中最為普遍的一種物理方法[28]。此方法可以將酶固定在包埋材料內，這種包埋材料能夠讓小分子底物以及代謝產物自由通過，底物在包埋材料里與酶接觸并反應[29]。包埋材料通常有海藻酸鈉(SA)、聚乙烯醇(PVA)、驟丙烯酰胺(PAM)、瓊脂等。該方法的優點是操作簡單，固定酶的時候酶未發生化學和物理變化[30]，對酶的高級結構改變較少，酶回收利用率高。因為此方法把酶固定在包埋劑中而形成固定化小球，所以固定化小球結構較穩定，強度大，不易滲漏，不易受外界因素影響[31]。

物理固定化方法還可以采用熱處理法，可以進行菌體固定。菌體是酶的供體，同時也是酶的載體。因為酶在高溫下容易變性失活，所以并不適合所有的酶，只能用于那些熱穩定好的酶，并且還要嚴格控制處理溫度和加熱的時間。此方法可以和其它方法綜合使用。

4 結 語

由于酶作為生物催化劑具有價格昂貴、壽命有限等缺點，而酶固定化技術可以使酶重復使用，增加酶穩定性等，因此在生物醫學、食品行業、環境工程中具有廣泛的應用前景。

目前，各種載體固定化酶都各自有優缺點，因此發展方向應為：開發更多更實用的載體，或者進行多種載體復合以消除單一載體的弊端；隨著大數據和互聯網+的到來，建立酶固定化技術的數據庫也是十分必要的；還可以采用計算機推測合理的載體結構，然后再進行實驗。