半枝蓮中4種黃酮類化合物的含量測定*

SONG Haneun(宋漢恩)，任 燕

(濱州醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺 264003)

半枝蓮主要產(chǎn)于華東、華南、西南等地[1]，其全草入藥。半枝蓮具有多種功效，不僅可內(nèi)用于治療多種炎癥，也可外用于跌打損傷[2]，但最為引人注目的是其抗癌功效[3-7]。半枝蓮化學(xué)成分多樣[8]，多名學(xué)者已經(jīng)證明半枝蓮中黃酮類物質(zhì)為主要的藥效物質(zhì)[9-10]。目前，半枝蓮中已檢測出幾十種黃酮類物質(zhì)[4-5]。其中野黃芩苷、野黃芩素、木樨草素和芹菜素是其主要的黃酮類成分，均具有一定的抗癌功效。因此，本試驗(yàn)選用半枝蓮中野黃芩苷、野黃芩素、木樨草素和芹菜素作為研究對象，建立一種同時測定半枝蓮中這四種化合物的高效液相色譜方法，該方法亦可用于不同產(chǎn)地半枝蓮中這四種黃酮類化合物的含量測定，用以判定藥材質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱；TB-215D電子分析天平，丹佛儀器有限公司；EL204電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.2 試 藥

野黃芩苷、野黃芩素、木樨草素、芹菜素，均購自青島捷世康生物科技有限公司。甲酸、甲醇、乙腈為色譜純，乙醇為分析純，純水。半枝蓮藥材來自四川、山東、江西、江蘇、湖南、湖北、河北、安徽、云南9個不同產(chǎn)區(qū)，由濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥學(xué)教研室陳彩云鑒定為唇形科植物半枝蓮ScutellariabarbataD.Don的干燥全草。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)；流動相：A：甲醇；B：乙腈；C：0.1%甲酸水；梯度洗脫(見表1)；流速：1.0 mL/min，紫外檢測波長：335 nm，進(jìn)樣量：10 μL，柱溫：30 ℃。

表1 梯度洗脫程序

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液

分別稱取野黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品、野黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品、木樨草素標(biāo)準(zhǔn)品與芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品適量，加甲醇制成濃度分別為1.02 mg/mL、0.221 mg/mL、0.205 mg/mL、0.200 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液。

2.3 供試品溶液

半枝蓮粉碎后，取藥材粉末約0.1 g，置于10 mL帶蓋EP管中，加50%乙醇水3 mL，充分浸泡后，100 kHz，60 ℃條件下超聲60 min(期間每隔5 min劇烈震搖一次，保證藥材提取充分)，然后靜置至室溫，離心后將上清液取出，進(jìn)樣(10 μL)，進(jìn)行分析。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別取“2.2”、“2.3”項(xiàng)下制備的對照品溶液和供試品溶液各10 μL，按“2.1”的確定的色譜條件測定。結(jié)果供試品中四種黃酮類化合物得到了很好的分離，結(jié)果見圖1。

圖1 四種黃酮類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)品(a)和半枝蓮樣品(b)的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of mixed standard for four flavonoids(a); scutellaria barbata(b)

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性關(guān)系

將“2.2”配制好的各個濃度的4個化合物標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液，按“2.1”確定的色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，分別以四個化合物標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，野黃芩苷、野黃芩素、木樨草素、芹菜素分別在濃度范圍10.20～1020 μg/mL、2.21～221 μg/mL、2.05～205 μg/mL、2.00～200 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，結(jié)果見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

2.5.2 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)

各取稱量半枝蓮的粗粉(0.1 g)，按照“2.3”的方法條件下用于精密度、穩(wěn)定性的考察?？疾炀芏仍囼?yàn)同一天連續(xù)進(jìn)樣6次，考察穩(wěn)定性試驗(yàn)分別于0 min、360 min、720 min、1080 min、1440 min、1800 min、2160 min各進(jìn)樣一次，共進(jìn)樣7次，由見表3可知，4個化合物的色譜峰的保留時間和峰面積的精密度、穩(wěn)定性RSD值均小于2.0%，表明該方法精密度、穩(wěn)定性良好。重復(fù)性試驗(yàn)取同一稱量的半枝蓮粗粉(0.1 g)，稱取6份，按“2.3”方法制成供試品溶液，分別進(jìn)樣一次。結(jié)果4個化合物的色譜峰的保留時間和峰面積的RSD值均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。結(jié)果見表3。

表3 供試品保留時間和峰面積的RSD值

2.5.3 加樣回收率

取少量江西半枝蓮粗粉6份，精密各稱取0.05 g，分別加野黃芩苷、野黃芩素、木樨草素、與芹菜素適量，加50%乙醇3 mL，使上述4個標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為142.1 μg/mL、16.27 μg/mL、5.300 μg/mL、8.730 μg/mL。按“2.3”方法超聲提取，測定回收率，結(jié)果(見表4)測得回收率都在90.17%～107.4%范圍之內(nèi)，回收率滿足樣品分析的要求。

表4 加樣回收率

2.6 九個不同產(chǎn)地半枝蓮中4種黃酮類化合物的含量測定

對九個不同產(chǎn)地半枝蓮進(jìn)行含量測定，結(jié)果見表5。結(jié)果表明這四種黃酮類化合物在九種不同產(chǎn)地的半枝蓮中含量相差很大，其中以山東所產(chǎn)的半枝蓮中這四種黃酮類化合物的總量最高，且野黃芩苷在山東產(chǎn)半枝蓮中含量最高，野黃芩素在江蘇產(chǎn)半枝蓮中含量最高，木樨草素，芹菜素在湖南產(chǎn)半枝蓮中含量最高。

表5 九個不同產(chǎn)地半枝蓮中4種黃酮類化合物含量測定結(jié)果

3 結(jié) 論

3.1 提取溶劑醇水比的選擇

本試驗(yàn)對半枝蓮粉末提取溶劑的醇水比進(jìn)行了考察，分別以1:10、3:7、1:1、7:3、9:1五種溶劑醇水比進(jìn)行考察，其中醇水比為1:1(50%醇水比)時，四種黃酮類化合物的色譜峰的峰面積最大，所以本試驗(yàn)最終確定50%醇水比為最佳的提取溶劑醇水比。

3.2 物料比的選擇

本試驗(yàn)對物料比分別為1:30、1:50兩種情況進(jìn)行研究考察。其中物料比為1:30時，4種黃酮類化合物的色譜峰的峰面積最大，所以本試驗(yàn)最終確定30倍用量的溶劑體積為最佳的提取溶劑用量。

3.3 流動相選擇

由于黃酮類物質(zhì)的極性較大，且4種化合物結(jié)構(gòu)相類似，因此采用梯度洗脫。其中甲醇-乙腈-0.1%甲酸水溶液系統(tǒng)的梯度洗脫效果最好，且各成分的峰都能較好的分離，并有合適的保留時間，所以選擇甲醇-乙腈-0.1%甲酸水溶液系統(tǒng)為最終流動相。

3.4 檢測波長的選擇

335 nm波長出現(xiàn)的色譜峰較多，并且大部分色譜峰吸收最強(qiáng)，因此確定335 nm波長作為檢測波長。