虎杖根中黃酮類化合物對脂氧合酶活性抑制*

吳桂玲，孫賽蘭，馮定坤，劉品禎

(黔南民族師范學院化學化工學院，貴州 都勻 558000)

虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc)為寥科屬多年生草本植物，主要分布于華東、中南、西南及河北、陜西、甘肅等地，它具有抗腫瘤、降壓、降血脂、祛痰止咳、保肝、鎮痛等藥理作用[1]。虎杖的化學成分比較復雜，主要包括蒽醌類、虎杖苷、黃酮類、二苯乙烯類、酚性成分、大黃素等。黃酮類化合物在虎杖中含量較少，但是具有抗氧化、調節心血管系統等顯著藥理作用[2]。黃酮類化合物在抑制脂肪酶等方面也有一定的效果，是目前食品和醫藥品競相開發的重點領域[3-4]。

脂氧合酶(lipoxygenase，LOX，ECl.13.11.12)，俗稱脂肪氧化酶、是一種單核非血紅素鐵酶。最早是在大豆中發現的，在很多動植物中也存在，它能夠催化植物體中的一些物質發生加氧反應，再經過一系列的作用，使植物體產生一些具有特殊風味的物質[5]，像谷子發生陳化[6]。已有研究發現茶葉產生陳味主要是由于茶葉中的LOX引起的[7]，動物體中的脂氧合酶主要是催化動物體中的花生四烯酸發生過氧化反應，高血壓、腫瘤、哮喘、動脈粥樣硬化等疾病的發生和發展都與LOX的代謝活性作用有關。有研究表明在前列腺癌和乳癌等癌癥中，都有LOX的過表達[8-9]，抑制LOX可預防惡性腫瘤的發生。已有研究表明，植物中LOX與人和動物組織中LOX有相似的催化活性，Belman發現如果某種抗氧化劑能阻止花生四烯酸氧化，那么這種抗氧化劑也具有抗癌、防癌的作用[10]，這是因為哺乳動物中的脂氧合酶的結構與植物中的脂肪氧合酶結構類似，兩種脂氧合酶對花生四烯酸的作用機理也相似。已有研究發現黃酮類化合物可以作用于脂氧合酶[11-12]，因此，借助于黃酮類化合物對大豆和毛尖茶葉中脂肪氧合酶活性的抑制作用，對于研究新工藝來開發合適的酶抑制劑有重要的指導意義。本研究以黔南州虎杖根為原料，以乙醇回流的方法提取了虎杖根中黃酮類化合物，并且探討了虎杖根中黃酮類化合物和人工合成抗氧化劑BHA和BHT對大豆LOX和都勻毛尖茶葉中的LOX活性的抑制作用。為進一步研究植物LOX活性抑制機理奠定基礎，該研究有助于將黃酮類化合物應用于體外篩選天然抗腫瘤活性物質。

1 實 驗

1.1 材料、試劑及儀器

虎杖，采自貴州省都勻市，將虎杖根洗凈置于電熱恒溫鼓風干燥箱中干燥后取出用高速萬能粉粹機粉粹得最終樣品，大豆,貴州產；毛尖茶葉采自都勻團山；蘆丁(含量≥95.0%)，國藥集團化學試劑有限公司；吐溫20，阿拉丁；純度為99.9%的亞油酸，阿拉丁；pH=6.3的麥氏緩沖溶液；叔丁基茴香醚(BHA)；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)，其他化學試劑均為分析純。

CL-2型恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司；多功能粉碎機，永康市速鋒工貿有限公司；DHG-9243BS-III型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海新苗醫療器械制造有限公司；FA2004電子分析天平，天津天馬衡基儀器有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；GTR21-1高速冷凍離心機，上海趙迪生物科技有限公司；RE-2000A旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-DIII循環水式多用真空泵，鄭州英三谷華儀器有限公司；PHS-3C精密pH計，上海盛磁儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 虎杖根中黃酮類化合物的提取

準確稱取虎杖根樣品2.0000 g于圓底燒瓶中，加入石油醚進行加熱回流1 h，抽濾，棄濾液，留濾渣，將濾渣置于圓底燒瓶中用70%的乙醇60 mL于80 ℃進行回流提取兩次，每次2 h，再抽濾，將濾液進行旋轉蒸發，得到膏狀物，加入一定體積的無水乙醇和少量的無水甲醇溶解，定容至250 mL或100 mL待測。

1.2.2 蘆丁標準曲線制作

將蘆丁標準品充分干燥直至重量不再發生變化，準確稱取樣品0.0200 g，用少量無水甲醇和一定體積的無水乙醇配置濃度為0.20 mg/mL的蘆丁標準溶液100 mL。

在7支25 mL的容量瓶中分別加入0.00，1.00，2.00，3.00，5.00，7.00，9.00 mL蘆丁標準溶液，在每支容量瓶中加入質量分數為5%的亞硝酸鈉溶液1.00 mL，充分搖勻，放置6分鐘；再加入5%的硝酸鋁溶液1.00 mL，再次搖勻后，放置5分鐘；最后加入4%的氫氧化鈉溶液10.00 mL，搖勻，接著用無水乙醇定容，放置15分鐘至20分鐘，在最大吸收波長500 nm處測定溶液的吸光度A，以試劑作空白對照，記錄數據，不同濃度c的蘆丁標準溶液會測得不同的吸光度A，用A為縱坐標，c為橫坐標，繪圖。

1.2.3 虎杖根中黃酮類化合物含量的測定

在波長為500 nm處測定吸光度。分別取適量待測液于25 mL 容量瓶中，再按照1.2.2的操作步驟依次在容量瓶中加入NaNO2溶液、Al(NO3)3溶液、NaOH溶液，搖勻，最后用無水乙醇溶液定容，按照1.2.2的操作步驟，根據1.2.2得到的回歸方程，計算出黃酮類樣品的濃度。

1.2.4 大豆中LOX的提取[3]

先用蒸餾水洗凈大豆，在0～10 ℃的溫度下先把大豆磨碎，然后再用石油醚進行多次浸提，最后得到脫脂大豆粉。稱取脫脂大豆粉24.3 g，以料液比為1:10(g/mL)，加入243 mL的去離子水，調pH值至4.5，攪拌50 min，抽濾；向濾液中加入固體硫酸銨使其飽和度達到40%，將濾液低溫(4 ℃左右)離心20 min；再次加入固體硫酸銨到上清液中，使溶液的飽和度達到60%。再離心20 min，用pH 9.0的0.2 mol/L的硼酸鹽緩沖液溶解沉淀，得到大豆粗酶液，低溫冷藏備用。

1.2.5 大豆中LOX的活性測定[3]

底物的制備：先配制pH值為9.0的硼酸鹽緩沖溶液，使其濃度為0.2 mol/L，然后取0.25 mL吐溫20分散在硼酸鹽緩沖溶液中，邊搖動溶液邊滴加亞油酸0.27 mL，使它們混合均勻，再加入1 mol/L的NaOH溶液，邊加邊搖動，直到使整個體系澄清，將溶液pH值調到9.0，然后用硼酸鹽緩沖液定容到500 mL作為底物備用。

用分光光度法測定茶葉脂氧合酶(LOX)的酶活性。以溫度60 ℃，pH值為6.3，15 mL反應體系，其中底物為亞油酸鈉，以最大吸收波長234 nm處的吸光度值每分鐘增加0.001個單位定義為一個酶活單位。具體操作如下：15 mL反應體系中含粗酶液1.0 mL，亞油酸鈉母液250 μL，以及緩沖液。在水浴中反應，水浴溫度為50 ℃，反應2 min時測一次234 nm處的OD值，反應4 min時再測一次，觀察兩次OD值的變化，進行3次平行實驗。

式中：A為酶活性單位：OD4 min為反應4 min的OD值；OD2 min為反應2 min的OD值。

1.2.6 黃酮類化合物對大豆LOX活性抑制測定

在5只潔凈干燥的試管中加入黃酮類化合物，體積分別為4 μL、5 μL、6 μL、8 μL、10 μL的黃酮類化合物，將5只試管分別按照1.2.5中測定酶活性的步驟操作，整個反應體系都一樣，只是多了一定體積的黃酮類化合物，測出反應液在234 nm 出的活性，按照抑制率計算公式計算：

式中：A0為無黃酮類化合物時的酶活力；A1為加黃酮類化合物時的酶活力。

1.2.7 都勻毛尖茶葉中LOX的提取[13]

將新鮮的毛尖茶葉晾干后剪碎，稱取10 g剪碎的茶葉，準確量取200 mL的麥氏緩沖液與茶葉混勻2分鐘后將混合液過濾，取濾液低溫高速離心5 min，取上清液，向上清液中加入固體(NH4)2SO4使溶液的飽和度為30%，在冰箱中靜置4 h。再次將溶液低溫高速離心5 min。在上清液中加入固體硫酸銨使其飽和度為70%。將溶液放入冰箱中靜置24 h左右，將溶液低溫離心10 min，進行過濾，將沉淀用麥氏緩沖溶液進行溶解，溶液即為茶葉的粗酶液，放入冰箱冷藏備用。

1.2.8 都勻毛尖茶葉中LOX活性的測定

方法同1.2.5，將大豆脂氧合酶酶液換為都勻毛尖茶葉的脂氧合酶酶液。

1.2.9 黃酮類化合物對毛尖茶葉LOX活性抑制的測定

方法同1.2.6，將大豆脂氧合酶酶液換為都勻毛尖茶葉的脂氧合酶酶液。

2 實驗結果

2.1 蘆丁標準曲線的繪制

在最大吸收波長500 nm處測定溶液的吸光度A，以試劑作空白對照，記錄數據，不同濃度c的蘆丁標準溶液會測得不同的吸光度A，用A為縱坐標，c為橫坐標，繪圖，可以得到蘆丁標準曲線回歸方程為y=10.87412X + 0.0086，相關系數R2=0.9995。結果見圖1。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 虎杖根中黃酮類化合物含量測定

由2.1得到的回歸方程，可以計算出虎杖根中黃酮類化合物的提取率為16.92%。

2.3 大豆LOX活性測定

根據1.2.5酶活力計算公式，在60 ℃，pH值6.3下，大豆LOX的酶活力A=37.165。

2.4 虎杖根黃酮類化合物以及BHA、BHT對大豆LOX的抑制作用

在溫度為60 ℃，pH為6.3，濃度相同條件下，虎杖根黃酮類化合物和BHA、BHT均可以抑制大豆脂肪氧合酶活性，隨著濃度的增加，抑制率逐漸增強。見圖2。計算得：BHA：IC50=1.89 mg/mL，BHT：IC50=1.77mg/mL，虎杖根黃酮：IC50=12.53 mg/mL。

圖2 虎杖根黃酮、BHA和BHT對大豆LOX的抑制率Fig.2 Theinhibition rate for LOX in soybean of flavonoids from the root of Polygonum cuspidatum, BHA and BHT

2.5 茶葉中LOX的活性測定

根據1.2.5酶活力計算公式，在60 ℃，pH值6.3下，茶葉LOX酶活力A=33.1。

2.6 虎杖根黃酮類化合物以及BHA、BHT對毛尖茶葉LOX的抑制作用

在溫度為60 ℃，pH為6.3，濃度相同條件下，虎杖根黃酮類化合物和BHA、BHT均可以抑制毛尖茶葉LOX活性，隨著濃度的增加，抑制率逐漸增強。見圖3。計算得：BHA:IC50=1.98 mg/mL，BHT：IC50=1.76 mg/mL，虎杖根黃酮：IC50=9.17 mg/mL。

圖3 虎杖根黃酮、BHA和BHT對毛尖茶葉LOX的抑制率Fig.3 Theinhibition rate for LOX in Maojian tea of flavonoids from the root of Polygonum cuspidatum, BHA and BHT

2.7 討 論

相同條件下，黃酮類化合物對大豆和毛尖茶葉LOX抑制性與人工合成抗氧化劑BHA和BHT對LOX活性的抑制性都不同，可能是由于不同的抗氧化劑他們的結構也不相同[14]。以前的研究發現密蒙花中的黃酮類化合物也可以抑制大豆脂氧合酶的活性[3-4]，本實驗發現虎杖根總黃酮對大豆LOX和毛尖茶葉中的LOX的也都有一定的抑制作用。虎杖根黃酮類化合物對大豆LOX活性的抑制性比對茶葉LOX活性的抑制性稍微弱些，可能是由于大豆LOX的活性比毛尖茶葉LOX的活性稍強。

3 結 論

本實驗以虎杖根為原料，以乙醇回流法提取了虎杖根中的黃酮類化合物，得到的提取率為16.92%。虎杖根中黃酮類化合物對大豆LOX有一定的抑制作用，也可以抑制毛尖茶葉LOX的活性，在溫度為60 ℃，pH為6.3條件下，虎杖根黃酮對大豆LOX和毛尖茶葉LOX活性的抑制性隨著黃酮類化合物和人工合成抗氧化劑濃度的增大而逐漸增強，人工合成抗氧化劑對LOX的抑制性比虎杖根黃酮類化合物的抑制性強，黃酮類化合物對毛尖茶葉LOX活性的抑制性比對大豆LOX的稍微強些。通過此研究有助于將黃酮類化合物應用于體外篩選天然抗腫瘤活性物質研究奠定理論基礎。