含中藥動物血清干預退變椎間盤細胞的研究進展▲

唐少雄 呂友慧 宋 凱 楊利學

(1 陜西中醫藥大學第一臨床醫學院， 咸陽市 712000，電子郵箱:tangsx3@163.com;2 陜西中醫藥大學附屬醫院脊柱骨科，咸陽市 712000)

【提要】 目前實驗研究已證實中醫藥防治椎間盤突出有確切療效。運用含中藥動物血清進行體外干預退變椎間盤細胞有效、可行，不僅克服倫理問題，還能夠反映藥物在體內真實狀態，有助于深入探究中醫藥在防治椎間盤退變的作用機制。本文就含中藥動物血清干預動物及人椎間盤細胞的研究進展進行綜述。

椎間盤退變是引起頸部或腰背部疼痛的一種常見病因，影響人類健康及生活水平，嚴重時可造成高致殘率和巨大的醫療成本。隨著中國社會經濟、醫療水平的不斷提升，高齡老人越來越多，退變性椎間盤相關腰腿痛的發病率也越來越高[1-2]。中醫藥防治椎間盤退變的效果受到關注，并且獲得大量動物實驗的驗證。然而，其作用機制仍未完全清楚，且動物實驗研究的作用機制是否等同于臨床作用機制，仍需在人體椎間盤細胞實驗中進一步去證實。

含中藥血清是指給動物服用一定量的藥物，經過一段時間后采集血液，離心后所得到的血清[3-4]。利用含中藥血清進行體外干預，可較為接近真實藥物在體內產生藥效的真實過程：藥物原有成分在體內或轉化為活性成分，或代謝后失活，或沒有被吸收入體內，或通過第二信使間接發揮作用。這使得體外實驗模擬了體內過程，達到了體外實驗能夠反映藥物體內真實狀態的目的[5-6]；克服了中藥粗制劑直接加入反應體系中進行體外實驗的缺點，能從一定程度上反映中藥方劑復雜體系與生物機體的復雜生命系統的相互作用的規律。相比于直接以中藥復方制劑干預的體外實驗，制備含中藥血清進行的體外研究，其結果更具科學和可信度[7-8]。本文就含中藥動物血清干預退變椎間盤細胞的研究進展做一綜述。

1 椎間盤退變機制

椎間盤是相鄰兩個椎體間獨特的組織，其包含外層和中央部，前者為富含彈性的Ⅰ型膠原蛋白纖維環，后者為富含Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖的髓核和軟骨終板[9]。椎間盤的退變與椎間盤細胞膠原蛋白合成減少、椎間盤蛋白聚糖降解增強、髓核細胞的減少均有著密切的關系[10-12]。在椎間盤退變各結構破壞改變中，最突出的是環撕裂、椎間盤脫出、終板損傷、椎管狹窄和椎骨內骨贅形成。單次沖擊、周期性和連續載荷、彎曲、軸向旋轉以及復雜的載荷機制等均影響椎間盤結構。但是，長期負重對脊椎的破壞更大，嚴重的后果包括代謝酶和生長因子的失衡、椎間盤應力分布的改變以及機械剛度的降低，從而導致脊柱生物力學受損。這一點也得到Vergroesen等[13]的研究結果的支持，其認為力學和生物學都是椎間盤退變的主要原因，且兩者相互聯系、相互放大。這種觀點也得到了越來越多的認可，即細胞生理受到機械負荷的強烈影響。Vergroesen等[13]同時提出，機械過載會導致分解代謝細胞反應和水結合細胞外基質變性的惡性循環。這不僅說明了椎間盤退變的復雜性，也解決了該領域的一些爭議，因為椎間盤的退變可以在任何時候進入惡性循環，最終導致相同的病理。

2 椎間盤退變的特征以及含中藥動物血清體外干預動物退變椎間盤細胞

相關學者通過動物實驗模型模擬人椎間盤退變過程，間接觀察人椎間盤退變特征。例如，Choi等[14]建立的SM/J模型小鼠品系概括了人類椎間盤退變的許多顯著特征，其退化過程的特征包括：(1)髓核細胞減少，椎間盤蛋白聚糖基質穩態發生紊亂，而椎間盤蛋白聚糖基質穩態失衡和損失更加速了椎間盤細胞衰老。無論是體內實驗還是體外實驗，椎間盤蛋白聚糖的快速喪失都能加速椎間盤細胞衰老[2]。(2)髓核與纖維環或終板軟骨之間的區別消失。(3)髓核和纖維環表現出較高的組織學等級。(4)聚集蛋白聚糖的作用顯著。(4)髓核中膠原蛋白X和基質金屬蛋白酶13的異常表達，以及軟骨細胞肥大的標志物Ⅹ型膠原蛋白α1、結締組織生長因子和Runx2的表達升高。(6)髓核細胞促進營養不良礦化。(7)椎間盤變硬，高度降低，椎骨質量變差。

研究表明，對動物退變椎間盤細胞進行含中藥血清體外干預是可行的，可直觀地了解到經過含中藥血清干預后椎間盤細胞形態學、病理學方面的改變[15-17]。牛凱等[18]運用含桃仁-紅花血清干預白細胞介素(interleukin)-1β誘導的大鼠退變椎間盤細胞，結果發現含中藥血清可抑制大鼠椎間盤軟骨終板細胞凋亡，并促進軟骨終板細胞的增殖，上調軟骨蛋白聚糖、Ⅱ型膠原蛋白α1和SOX9 mRNA表達，下調Ⅹ型膠原蛋白α1和IL-6 mRNA的表達。徐無忌等[19-20]、吳國華等[21]應用含六味地黃丸血清對兔椎間盤體外退變模型細胞進行干預， 發現其可以延緩兔椎間盤體外退變模型細胞外基質中糖胺多糖、硫酸軟骨素/硫酸角質素比值、透明質酸含量的降低程度，上調髓核細胞JNK及P38通路的mRNA含量及蛋白表達量，從而在一定程度上可以延緩椎間盤細胞的退變；同時其可降低椎間盤膠原蛋白總體含量下降速率，改善椎間盤內環境，從而減慢椎間盤退變進程，達到保護椎間盤的作用。以上研究表明，含中藥血清可通過抑制細胞凋亡、調節相關成骨因子或軟骨相關因子、細胞外基質成分等途徑，延緩椎間盤細胞的退變。這為含中藥血清干預人體退變椎間盤細胞奠定了一定的基礎。

3 含中藥動物血清干預人退變椎間盤細胞

3.1 含中藥動物血清干預人退變椎間盤細胞的可行性 應用含中藥動物血清干預人體細胞組織的體外實驗研究，可以有效地解決直接在人體實驗的倫理問題，并且可以在體外直觀觀察并檢測各類干預性指標。 有學者采用大鼠或家兔制備含中藥血清，成功干預人體腎小管上皮細胞、肝細胞、單核細胞、軟骨細胞[22-26]。應用動物含中藥血清成功干預人體不同組織細胞，為含中藥動物血清體外干預人體其他細胞開辟了新途徑，也為探索中醫藥治療疾病的現代機制打下了堅實的基礎。

3.2 含中藥動物血清干預人退變椎間盤細胞 隨著研究的深入，提取含中藥動物血清干預人體椎間盤組織也有了突破[27]。周紅海等[28]給大鼠灌胃益氣活血方后提取其含中藥血清作為藥源，對體外培養的人退變椎間盤髓核細胞進行干預，結果顯示，益氣活血方血清可上調非破裂型腰椎間盤突出退變髓核細胞中聚蛋白多糖 mRNA的表達，促進ColⅡ的合成，恢復椎間盤的剛性支撐框架，并可促進蛋白多糖的合成，增加與水的結合，對抗壓力，分散和吸收負荷，從而改善非破裂型突出腰椎間盤的組織結構和力學特性。陳江等[29]給新西蘭兔灌胃身痛逐瘀湯后提取含中藥血清作為藥源，發現身痛逐瘀湯血清對人退變髓核細胞活力、形態及超微結構具有保護作用，推測其可能通過上調磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路的表達延緩人髓核細胞凋亡，從而延緩椎間盤退變。周文明等[30]給大鼠灌胃補腎壯督方后提取含中藥血清作為藥源，對人髓核細胞退變模型進行體外干預，結果顯示，補腎壯督方血清可有效抑制髓核細胞凋亡，其可能通過減少B細胞淋巴瘤2相關X蛋白、凋亡酶激活因子1、細胞色素C的蛋白及mRNA表達，增加B淋巴細胞瘤-2蛋白表達，從而減少線粒體信號通路所導致的髓核細胞凋亡，改善椎間盤退變。以上實驗研究表明，中藥復方在人體內可能通過抑制椎間盤細胞凋亡、調節相關膠原蛋白及基因的表達、改善椎間盤微結構，從而達到延緩椎間盤退變。

4 小 結

應用含中藥動物血清進行中藥藥效作用的觀察、研究，能更好地反映藥物在體內環境中產生藥效的真實過程，在理論上更具有科學性與真實性，有利于從細胞分子水平上探討中藥的作用機理。含中藥動物血清替代人血清體外干預人體細胞的成功，轉換了以往完全脫離人體的動物實驗，進而可以在體外直觀地觀察人體細胞在中藥干預下的變化過程，使實驗研究更加貼近藥物在人體的藥效反應過程，運用含中藥動物血清干預人退變椎間盤細胞，克服了不能直接提取口服中藥后的人體血清及人退變椎間盤組織進行實驗研究的倫理學問題，觀察到的結果更接近中藥在人體中的作用結果。因此，運用含中藥動物血清進行體外干預退變椎間盤細胞是有效、可行的，可更加深入地探究中醫藥在防治椎間盤退變過程中的作用機制，為中醫藥臨床治療腰椎間盤突出癥提供科學依據。而諸多的含中藥動物血清體外細胞學實驗研究表明，含中藥血清可有效改善、延緩椎間盤細胞退變。其可能通過抑制椎間盤細胞的凋亡、抑制椎間盤膠原蛋白含量下降、增加椎間盤膠原蛋白的表達、保護椎間盤細胞超微結構、維持椎間盤蛋白聚糖基質穩態等方面防治椎間盤退變。