以種子電導率為指標定位水稻耐儲藏QTL

曹玉潔費月新趙文佳 侯璐燕 王越 吳敏 許珊 吳洪愷

（浙江農林大學農業(yè)與食品科學學院，杭州311300；#共同第一作者；*通訊作者：hongkaiwu＠163.com）

水稻是中國乃至世界上最重要的糧食作物之一，為了保證農業(yè)生產安全和糧食安全，需要對水稻種子和稻谷（糧食）進行儲備。但是，長期儲藏后，往往造成種子生活力下降，稻米品質劣變。因此，水稻耐儲藏研究是一個重要的研究方向。

水稻種子耐儲性的評價主要采用種子活力等方面的指標，如發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數等,這些指標能完整反映種子（生）活力變化的情況，同時也更能表現生產實際狀況，因此廣泛應用在水稻種子耐儲性相關研究中[1-2]。種子在清水中浸出液的多少可以間接反映種子細胞膜系統(tǒng)的完整性和種子老化的程度，種子浸出液多，種子老化程度深，電導率增加。因此，種子浸出液電導法作為一種簡易、快速、客觀的種子活力測試方法，已經廣泛應用于許多物種的種子活力檢測[3]，并形成了國際標準方法[4]。也有報道指出，種子浸出液電導法可用于稻米（糧食）陳化的谷物化學研究。周顯青等[5]研究表明，隨著稻谷儲藏時間的延長和陳化程度的加深，種子浸出液電導率逐漸增大，能反映不同儲藏年限稻谷品質的差異。

可見，種子浸出液電導率既可以評價種子儲藏老化后的（生）活力，又可以評價稻米（糧食）儲藏后品質劣變的程度。因此，種子浸出液電導率是研究水稻耐儲藏性狀的理想指標。筆者以種子浸出液電導率為指標，用本實驗室構建的高代回交群體為材料，進行了稻米耐儲藏QTL的定位，結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以揚稻6號為供體親本，粳稻秀水134為受體親本，雜交獲得F1，與輪回親本秀水134連續(xù)回交3次，自交1次，得到BC3F2群體。種子收獲后，自然曬干至含水量13%，常規(guī)條件下，室溫儲藏16個月備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 多態(tài)性分子標記的篩選和連鎖圖譜的構建

根據McCouch等構建的分子標記連鎖圖譜[6]，選擇分子標記進行秀水134和揚稻6號間多態(tài)性分析；用Mapchart 2.2繪制多態(tài)性SSR標記連鎖圖。

1.2.2 相對電導率的測定

參照ISTA方法[4]進行。每個株（系）隨機稱取飽滿未破損的種子50粒，放入100 mL燒杯中，用量筒量取50 mL去離子水加入燒杯中，用保鮮膜覆蓋燒杯口，使其呈密封狀態(tài)，放置在22℃的培養(yǎng)箱中24 h。揭去保鮮膜，輕輕攪拌，穩(wěn)定后，用DDS-307A型電導儀測定。以相同的去離子水為空白對照，重復4次。

電導率（μS/cm）=（樣品浸出液電導率-空白對照電導率)/樣品種子質量。

1.2.3 QTL 檢測

用SPSS軟件進行性狀-標記基因型的單因素方差分析，計算目標性狀在分子標記基因型間的差異由誤差造成的概率P。用-log10（P）的大小來表示該位點存在QTL的可能性大小。以-log10（P）為縱坐標，分子標記遺傳距離（cM）為橫坐標做折線圖，取-log10（P）＞2（即p＜0.01）為閾值，進行QTL分析，計算QTL相對加性效應值和貢獻率。

圖1 秀水134和揚稻6號間多態(tài)性分子標記連鎖圖譜

圖2 電導率次數分布圖

A位點QTL相對加性效應值=（A3A3表型值-A1A1表型值）/2×A1A1表型值×100%。

A3A3表示供體親本基因型；A1A1表示背景親本基因型。

QTL貢獻率=基因型間平方和/總平方和×100%。

2 結果與分析

2.1 SSR分子標記連鎖圖譜的構建

根據McCouch（2002）構建的分子標記連鎖圖譜[6]，選擇了629對引物，進行秀水134和揚稻6號間多態(tài)性分析，篩選到兩個親本間有多態(tài)的引物263對，親本間多態(tài)性比例為41.8%。選擇PCR擴增條帶分辨清晰，且均勻覆蓋水稻12條染色體的95對多態(tài)性分子標記，用Mapchart2.2繪制多態(tài)性SSR標記連鎖圖（圖1），全基因組總長度為 1 499.6 cM。

2.2 群體耐儲藏特性的表現

本研究所用的群體包括615個個體。這615個個體的電導率分布見圖2，電導率值最大的為38.12 μS/（cm·g），最小的為5.45 μS/（cm·g），平均值為14.94 μS/（cm·g）。大部分個體的電導率分布在9～21 μS/（cm·g）之間，占比91.73%。同時，還存在極端個體，暗示該群體中可能存在效應較大的減效或增效QTL。

表1 水稻種子電導率為指標的耐儲藏QTL檢測

2.3 耐儲藏特性QTL分析

用SPSS軟件進行表型值-基因型單因素方差分析，用-log10（P）值的大小來表示某一位點存在QTL可能性的大小，該值越大，則QTL存在的可能性越大。以-log10（P）為縱坐標，分子標記遺傳距離（cM）為橫坐標做折線圖，取-log10（P）＞2（即p＜0.01）為閾值，檢測到16個耐儲藏相關的QTL，結果見圖3。

除第10和第12染色體上未檢測到控制電導率的QTL外，其余10條染色體均檢測到。其中，第3條染色上檢測到的QTL最多，有4個，占總數的25%。計算16個QTL的相對加性效應與貢獻率，得到表1。16個QTL 中，有 6 個 QTL（qEC-11-2、qEC-11-3、qEC-5-1、qEC-3-2、qEC-2、qEC-3-6）表現為正效應，即來自供體（揚稻6號）的等位基因是增效基因，其相對加性效應變幅范圍為 2.65%～12.83%；其余 10 個 QTL（qEC-8-1、qEC-1-1、qEC-3-3、qEC-1-2、qEC-9-1、qEC-6-1、qEC-3-4、qEC-4-1、qEC-6-4、qEC-7-2） 表現為負效應，即來自供體（揚稻6號）的等位基因是減效基因，其相對加性效應變幅范圍為-12.93%～-0.30%。16個QTL的貢獻率變幅范圍為1.51%～6.60%，其中，第7染色體上的qEC-7-2貢獻率最大，為6.6%；其-log10（P）值也最大，為8.95，是可能性最大的控制電導率的QTL。

3 討論

種子電導率的變化反應了細胞膜的完整性[7]，既可以評價種子儲藏老化后的活力，又可以評價稻米（糧食）儲藏后陳化的程度，可以綜合全面評價水稻的耐儲藏特性。以電導率來評價水稻耐儲藏特性操作簡單，結果客觀，所需時間短，因此得到了廣泛應用[8]。但是，電導率的遺傳研究未見報道。

我們以高代回交群體BC3F2為材料，分析了控制電導率的基因位點，共檢測到16個QTL，分布在除第10和第12染色體的其余10條染色體上。16個QTL的貢獻率變幅范圍為1.51%～6.60%，貢獻率都比較小，暗示電導率的遺傳比較復雜，影響因素多。對于復雜的遺傳性狀，染色體代換系是理想的研究群體[9-11]。染色體片段代換系具有許多非常突出的優(yōu)點，染色體片段代換系遺傳背景單一，每個代換系只有一個或少數幾個供體片段，這樣可以避免不同基因間相互作用來影響QTL定位，可以提高QTL定位的準確性；染色體片段代換系的每個個體都是純合穩(wěn)定的，可以提供大量的種子用于多點、多年、多重復的試驗，這樣可以提高QTL效應和貢獻率的精確性。